Ralstonia eutropha znana również jako Alcaligenes eutrophus CH34 oraz Ralstonia metallidurans to ulegająca odbarwieniu metodą Grama (tj. Gram-ujemna) pałeczka. Nie wytwarza spor, jest obligatoryjnym tlenowcem i może żyć w środowisku silnie metalicznym, toksycznym dla większości mikroorganizmów (Zn, Cd, Co, Pb, Hg, Ni i Cr). Tolerancje na tak ekstremalne środowisko zapewniają jej 2 duże plazmidy (pMOL28=180 kbp i pMOL30=240 kbp), których geny kodują białka wchodzące w skład pompy jonowej.

Ralstonia eutropha produkują organiczne polimery - polihydroksyalkany jako rezerwę tworzoną w odpowiedzi na ograniczoną dostępność czynników pokarmowych (N,P,S)przy nadmiarze pożywienia węglowego. Kontrolując zatem obecność tych składników w środowisku możemy sterować tym procesem. Ponadto, te same mikroorganizmy produkują enzym potrzebny do rozbicia polimeru w monomery, metabolizowane jako źródło węgla. To naturalne źródło sztucznych polimerów, dlatego ulega biodegradacji.

Obecnie w komercyjnej produkcji PHB prowadzi się biosyntezę z glukozy u Ralstonia eutropha. Jest to najlepiej scharakteryzowany szlak, polimer stanowi do 90% suchej masy komórek.

Australijscy naukowcy odkryli, że Ralstonia eutropha przyczyniają się do przejścia metali nieszlachetnych australijskich złoto („złoto głupców”). Odkrycia dokonano w południowej części Nowej Walii i północnej części Queensland w Australii. Złoto zostało znalezione w związku z pirytem w kwarcu i arsenopirycie. Po wyizolowaniu bakterii prowadzono przy pomocy mikroskopu elektronowego obserwacje procesu wytrącania się złota, proces formowania trwa ok. 8h. Obecnie, dzięki zdolnościom bakterii, opracowywane są metody szybkiego pozyskiwania złota z wód kopalnianych.

Źródła:

http://www.mhhe.com/biosci/pae/botany/botany_map/articles/article_28.html

http://www.chemicy.put.poznan.pl/materialy/MTAy

http://www.livescience.com/strangenews/060718_gold_bacteria.html

http://biotka.mol.uj.edu.pl/~micro/wyklady/mprzemw8_konspekt.pdf

Są to naturalne, przyjazne środowisku, poliestry, które mogą być przekształcane do biodegradowalnych plastików o szerokim zastosowaniu, np. oprócz tych tradycyjnych, mogą być użyte w medycynie lub w przemyśle papierniczym.

Są to poliestry liniowe, spotyka się jednak łańcuchy boczne – rozgałęzione i zawierające pierścień aromatyczny. Produkowane są naturalnie przez bakterie fermentujące cukry lub lipidy. Polihydroksyalkan może zostać utworzony z ponad 150 różnych monomerów, których kombinacje dają produkty o różnych właściwościach. Ich ogólna budowa to:

Rys.ogólny wzór monomeru wchodzącego w skład PHA

Polihydroksyalkany mogą tworzyć materiały termoplastyczne i elastomery o temperaturze topnienia od 40 do 180 °C, poza tym ich biokompatybilność może być zmieniana przez np. łączenie z innymi polimerami, enzymami i materiałami nieorganicznymi, co znacznie zwiększa możliwość ich zastosowań.

W ostatniej dekadzie nastąpił znaczny postęp w kontroli rodzaju powstających monomerów jakie wchodzą w skład PHA produkowany przez naturalne i transformowane mikroorganizmy. Kontrola składu PHA jest kluczowym czynnikiem wpływającym na fizyczne właściwości polimerów. W przypadku bakterii kontrola nad polimerami PHA może być wydajnie prowadzona poprzez manipulacje składu pożywek. Przykładowo Pseudomonas oleovorans rosnący na pożywce awierającej kwas dodekanowy produkuje PHA złożone z kwasu 3-hydroksydodekanowego, 3-hydroksyoktanowego, 3 hydroksydekanowego - 3-hydroksyheksanowego, podczas gdy ta sama bakteria hodowana na kwasie oktanowym produkuje PHA złożony tylko z kwasu 3-hydroktanowego i 3-hydroksyheksanowego.

W przeciwieństwie do powyższych dla fermentacji bakteryjnej kontrola nad składem monomerów wchodzących w skład PHA jest prowadzona na poziomie szlaku metabolicznego. Dostarcza się in situ do roślinach uprawnch 3-hydroksyacylo-CoA który po przekształceniu w komórce przechodzi w PHA. Na przykład zmiana stosunku monomerów sześcio węglowych do dzieisęciowęglowych albo dłuższych może być osiągnięte przez ekspresję przenośnika (caproyl-acyl) bialkowej tioesterazy w plastydzie A thaliana wraz z syntazą PHA P. aueroginosa w peroxysomie.

PHA są naturalnymi polimerami, które magazynowane są w mikroorganizmie, ponieważ nie powodują wzrostu ciśnienia osmotycznego w komórce ze względu na to, że są one nie rozpuszczalne w wodzie. Dodatkowo łatwo je przekształcić do octanu. Komórki bakteryjne kumulują PHA w cytoplazmie w postaci granulek o średnicy około 0,2 – 0,6 μm. Granulki otoczone są membraną połączoną z ważnymi enzymami odpowiadającymi za metabolizm polimeru. PHA jest wytwarzany, gdy rozmnażanie bakterii jest zahamowane przez zbyt duże ilości węgla w podłożu, a także, kiedy środowisku brakuje pierwiastków takich jak P, S, N, Mg, czasem O2. W warunkach naturalnych ilość PHA w suchej masie bakterii waha się od 1% - 3%. Natomiast, gdy proces jest kontrolowany polimer może zostać skumulowany do 80%.

Produkcja PHA na skalę przemysłową:

Rys.Produkcja PHA

http://www.eko.uj.edu.pl/kramarz/wyk%C5%82ady/metody/wyklad10.pdf

• Alcaligenes eutrophus,
• Spirillum spp.,
• Hypomicrobium spp.
• Pseudomonas spp.,
• Azospirillum,
• Rhodobacter spp.
• Rhodospirillum

Dwie drogi produkowania PHA przez mikroorganizmy

Poniżej zostanie opisany sposób produkcji najczęściej spotykanych polihydroksyalkanów:

a) poli β-hydroksymaślan [(hydroksymaślan)n] = polihydroksykwas masłowy (PHB - polyhydroxybutyrate)

b) poli hydroksy propionian [(mleczan)n] = poli kwas mlekowy

c) poli (hydroksybutyrano-kohydroksywalerianian) (PHB/V)

Najpopularniejszy - poli β-hydroksymaślan [(hydroksymaślan)n] = polihydroksykwas masłowy (PHB - polyhydroxybutyrate) – zawsze 3 węgle w łańcuchu głównym monomera, podstawniki mogą być różne. Rodzaj podstawników jest zależny od substratów oraz od rodzaju mikroorganizmu:

Rys.Monomer PHB

Ralstonia eutropha – produkcja H-, CH3-, C2H5- ; Pseudomonas oleovorans – produkcja C3H7-, C9H19- (zachodzi tylko, jeśli pożywką jest mieszanina kwasów tłuszczowych, czy alkanów).

Szlak syntezy (3 stopniowy, enzymy wyróżniono na zielono) prowadzony przez: Alcaligenes eutrophus, Azotobacter beijerinckii, Zooglea ramigera

Rys.Biosynteza PHB www.chemicy.put.poznan.pl/materialy/MTAy

1) kwas octowy z udziałem ATP przyłącza CoASH i powstaje Acetylo-CoA, muszą zajść 2 takie reakcje

2) B-ketotiolaza łączy acetylo-CoA i CH3COOH w Acetoacetylo-CoA, Z uwolnieniem HSCoA

3) redukcja Acetoacetylo-CoA do R-3-hydroksybutyrylo-CoA

4) syntaza PHB prowadzi do odłączenia HSCoA i powstania PHB

PLA wytwarzany jest z surowców odnawialnych. Największym producentem polilaktydu na świecie jest firma Nature Works LLC z USA. W Europie PLA produkuje PURAC, przed kilkoma laty powstała spółka joint venture pomiędzy Galactic i Total Petrochemical, której celem jest produkcja tego tworzywa.

Do produkcji PLA najczęściej wykorzystuje się kukurydzę lub buraki cukrowe.

Opisane zostaną 2 metody produkcji polikwasu mlekowego:

1. prowadzenie reakcji polimeryzacji z otwarciem pierścienia (ang. ring opening polimerization = ROP). Gdy surowce roślinne ulegają fermentacji jako produkt powstaje kwas mlekowy. Najpierw w reakcji polikondensacji jest on oligomeryzowany, żeby później po dehydratacji powstał cykliczny dimer.

Dimery polimeryzowane są w reakcji ROP w roztworze, w masie, w stopie i suspensji. Również mechanizm tej reakcji może być różny od kationowego i anionowy, poprzez koordynacji do rodnikowego

2. reakcja polikondensacji → powstaje polimer o niższej masie cząsteczkowej niż podczas ROP. W tej reakcji masy cząsteczkowe wynoszą ok 1,6 x 104, w reakcji ROP masy cząsteczkowe wynoszą 2 x 104 do 6,8 x 105.

Produkcja składa na skalę masową składa się z 3 etapów:

1. produkcja biomasy

• potrzebne jest źródło węgla, dla tego stosuje się pełną pożywka z glukozą

2. akumulacja PHA

• ograniczenie N, P, S, Mg, czasem niska zawartość O2. Najczęściej ograniczona ilość fosforanu
• dodatek glukozy + kwas propionowy
• czeka się, aż do osiągnięcia 80% PHA w suchej masie

3. downstream processing:

• dezintegracja komórek
• rozpuszczanie składników innych niż PHA
• opłukanie polimeru i wirowanie

www.chemicy.put.poznan.pl/materialy/MTAy

Podczas produkcji PBHV bardzo ważna jest kontrola składu, ponieważ wzrost produkowanego z kwasu propionowego – 3HV powoduje wzrost elastyczności polimeru, a dodatek octanu powoduje wzrost szybkości syntezy. Octan jest bezpośrednio przekształcany w Acetylo-CoA

Operon: phbCAB : synteza, reduktaza i tiolaza są produkowane w PHA o krótkich łańcuchach bocznych przez operon posiadający sekwencje phbC- phbA- phbB. Kontrola syntezy PHA o długich łańcuchach bocznych zachodzi przez operon posiadający sekwencje phaA, phaC1 i phaC2.

www.chemicy.put.poznan.pl/materialy/MTAy

Jak już wyżej powiedziano polihydroksykwasy alkanowe, to naturalne poliestry syntetyzowane przez wiele mikroorganizmów w wyniku fermentacji bakteryjnej. Nauczono się wytwarzać z nich materiały termoplastyczne przypominające, jeśli chodzi o właściwości, polietylen lub polipropylen. Ze względu na biodegradowalność i cechy mechaniczne, można je stosować w medycynie, przemyśle papierniczym, spożywczym, kosmetycznym. Są to jednak wyroby dużo bardziej kosztowne niż wyroby posiadające bazę w petrochemii, więc żeby nie ponosić strat finansowych ich zawartość powinna sięgać ok. 15%suchej masy. Badania wykazują, że produkcję można zwiększyć uzyskując rośliny, w których możliwe jest zlokalizowanie miejsca syntezy PHA lub PHBV w plastykach. Rośliny te powstały dzięki inżynierii genetycznej, tj. przez wprowadzenie i ekspresję genów kodujących cztery enzymy niezbędne do przeprowadzenia kolejnych etapów szlaku biochemicznego.

Jak pisze Wacław Orczyk z Samodzielnej Pracowani Inżynierii Komórkowej i Transformacji IHAR w Radzikowie w „Postępach nauk rolniczych”: Problem lokalizacji rozwiązano w ten sposób, że białka enzymatyczne po syntezie w cytoplaźmie były, dzięki odpowiednim sekwencjom liderowym, transportowane do chloroplastów i tam wspólnie z plastydową dehydrogenezą pirogronianową przekształcały acetylo-CoA i propionylo-CoA w produkt końcowy – PHBV.

Po raz pierwszy opatentowano przeniesienie genów PHB do rośliny w 1989, chciano wówczas komercyjną produkcją pozyskać P(3HB-co-3HV) prowadzoną na względnie małą skalę, bo ekonomia jest bezwzględna – znacznie tańsza jest produkcja materiałów z ropy. Jak dalej pisze Wacław Orczyk Opłacalna produkcja PHB w roślinach stałaby się możliwa, gdyby energia potrzebna w procesie technologicznym także pochodziła z roślin.PHB wytwarzany na przykład w trzcinie cukrowej, mógłby być ekstrahowany z wykorzystaniem energii pochodzącej z cukru równolegle pozyskiwanego z tych samych roślin.<br>Pomysł ten został oparty na technologii produkcji etanolu z cukru trzciny cukrowej wykorzystywanej w Ameryce Południowej.

Pierwszych prób wprowadzenia genów do rośliny dokonano na Arabidopsis thaliana. Wprowadzono wtedy gen R. eutropha do cytoplazmy, wyniki okazały się niezadowalające – wolny wzrost rośliny oraz mała wydajność ekspresji genu. Po wprowadzeniu genów do chloroplastów produkcja PHB wzrosła do 20% suchej masy, a P(3HB-co-3HV) 3% suchej masy. Synteza zachodziła w liściach. Próby prowadzone na rzepaku (Brassica napus) wyglądały następująco: synteza PHB – z wydajnością 8% i P(3HB-co-3HV) – z wydajnością 3% suchej masy. Produkcja PHA zachodzi w nasionach rośliny.

Fotografia z elektronu elektronowego nasiona podczas produkcji P(3HB)www.chemicy.put.poznan.pl/materialy/MTAy P – plastyk PHB – polimer L – lipid PB – białko

Dzięki inżynierii genetycznej oprócz modyfikacji roślin można przede wszystkim transformować bakterie. Takim sztandarowym przykładem w tej dziedzinie może być transformacja E. coli genami R. euthropha która osiągnąć wtedy może produkcje PHB do 80% suchej masy. Zauważono również, że w temperaturze 28o – 42oC wydzielenie polimeru jest szybsze i łatwiejsze.

Obecnie plastiki pochodzenia petrochemicznego są zbyt tanie, żeby alternatywne materiały miały bodziec do dynamicznego rozwoju, jednak drastyczne uszczuplanie źródeł tradycyjnych oraz oczywiście względy przyrodnicze motywują naukowców do badań i doskonalenia produkcji polihydroksyalkanów.

http://en.wikipedia.org/wiki/Polyhydroxyalkanoates#endnote_Doi-2002

http://www.medicalengineer.co.uk/articles/tissue/Polyhydroxyalkanoates-for-tissue-engineering.html

http://www.biotworzywa.nazwa.pl/index.php?option=com_content&task=view&id=106&Itemid=126

http://www.pfb.p.lodz.pl/dl/2005_01_13.pdf

http://www.chemicy.put.poznan.pl/materialy/MTAy

Wstęp

Kwas glukonowy jest jednym z najważniejszych produktów w grupie kwasów organicznych otrzymywanych na drodze biotechnologicznej. Stosowany jest głównie w przemyśle spożywczym do poprawy smaku potraw (jako przyprawa do zakwaszania produktów) oraz jako środek konserwujący. Stosowany jest również przy wytwarzaniu sztucznego miodu oraz przy wyrobie niektórych kiełbas i serów ( δ- glukonolakton). Może być również użyty w produkcji napojów gazowanych i proszków do pieczenia.

Kwas glukonowy znalazł również zastosowanie w przemyśle farmaceutycznym, tekstylnym a także metalurgicznym. Duże zastosowanie w różnych technologiach mają glukonian wapnia, glukonian sodu oraz glukonian potasu. W przemyśle farmaceutycznym glukonian wapnia używany jest jako łatwo przyswajalny związek wapnia dla ludzi i zwierząt, roztwory wodne glukonianu wapnia mają zdolność rozpuszczania skrzepów krwi. W przemyśle tekstylnym używany jest glukonian sodu w celu wybielania i nabłyszczania tkanin. W przemyśle metalurgicznym kwas glukonowy stosuje się do oczyszczania powierzchni metali przed nakładaniem powłok ochronnych. Glukonian potasu może być również stosowany jako czynnik, który zapobiega gromadzeniu nierozpuszczalnych soli wapnia, magnezu i żelaza na powierzchniach instalacji przemysłowych.

Rys.Kwas glukonowy Źródło: www.chemicalforum.eu

Światowa produkcja kwasu glukonowego przekracza 50 000 ton rocznie, co jest podyktowane bardzo dużym zapotrzebowaniem na ten kwas ze strony różnych gałęzi przemysłu.Obecnie większość tego surowca wytwarzana jest metodami biotechnologicznymi z wykorzystaniem drobnoustrojów. Do produkcji kwasu glukonowego stosuje się wyselekcjonowane (w drodze mutacji lub selekcji ze szczepów dzikich) wysoko wydajne szczepy grzybów strzępkowych – Aspergillus niger oraz bakterie z rodzaju Gluconobacter i Pseudomonas.

Biosynteza kwasu glukonowego:

Aspergillus niger – Kropidlak czarny

Grzyb strzępkowy, szeroko rozpowszechniony na świecie, często izolowany z gleby, lubi wilgotne miejsca. Jest jednym z powszechnych zanieczyszczeń żywności, powoduje jej pleśnienie -czarna pleśń. Grzyb ten okazał się wrogiem archeologii, ponieważ znajdowano go w komorach grobowców starożytnego Egiptu. Przed wejściem do grobowców znajdował się napis –kto naruszy spokój faraonów, ten musi pożegnać się z życiem. Gdy archeolodzy badali w środku sarkofagi, w których spoczywały mumie wdychali trujące zarodniki Aspergillus Niger, które powodowały u nich choroby płuc i naukowcy umierali. Jest to naukowe wyjaśnienie klątwy Tutenhamona. niezupełnie - śmiertelne są nie zarodniki, ale aflatoksyny!

Rys. Aspergillus niger Źródło:http://129.215.156.68/Images/spores.htm

Synteza oparta jest na reakcji utleniania glukozy do kwasu glukonowego przez enzym –oksydazę glukozową związaną z FAD. Oksydaza glukozowa wykazuje wysoką specyficzność reakcji utleniania β-D-glukopiranozy poprzez glukonololakton do kwasu glukonowego. Zredukowana oksydaza glukozowa przenosi wodór na tlen atmosferyczny z wytworzeniem nadtlenku wodóru, który jest rozkładany przez katalazę do wody i tlenu.

Produkcja przemysłowa kwasu glukonowego

Przemysłowe otrzymywanie kwasu glukonowego może być prowadzone metodą okresowej lub ciągłej hodowli wgłębnej prowadzonej na fermentatorach. Istnieje też możliwość produkcji tego kwasu przez wykorzystanie unieruchomionej na żelu algininianowym (immobilizacja) grzybni Aspergillus niger. Biosyntezę prowadzi się przeważnie w klasycznych fermentorach w ciekłych pożywkach o ściśle określonym składzie.

Substancje wchodzące w skład pożywki:

• źródło węgla – najczęściej czysta glukoza lub hydrolizaty skrobi ziemniaczanej
• źródło azotu i fosforu
• biostymulatory
• mikro i makroelementy

Korzystne warunki procesu:

• temperatura – w zakresie 30-32ºC
• pH 6,0-6,5- korygowane węglanem wapnia, wodorotlenkiem sodu lub potasu
• intensywne mieszanie
• odpowiednie napowietrzenie (dobre natlenienie środowiska)

Wapniowe, sodowe lub potasowe sole kwasu są wydzielane z filtratu po oddzieleniu biomasy. Zneutralizowany węglanem wapnia filtrat jest ogrzewany do ok.100 ºC i ochładzany do 20 ºC. Z przesyconego roztworu glukonian wapnia krystalizuje, a wydzielone kryształy są odwirowywane, kilkakrotnie przemywane zimną wodą i suszone w ok. 80ºC. Krystalizację można przyspieszyć przez zastosowanie małej ilości rozpuszczalnika mieszającego się z wodą np. alkoholu. Alternatywnie kwas glukonowy jest wydzielany z glukonianu wapnia w reakcji z kwasem siarkowym (VI) i po odfiltrowaniu osadu siarczanu (VI) wapnia (gipsu) zagęszczany do 50%. Glukonian sodu jest zagęszczany do 45% s.s. i następnie suszony-po korekcie kwasowości NaOH do pH 7,5- lub przeprowadzony w kwas metodą jonitową. Przy zastosowaniu odpowiednio aktywnego szczepu czas trwania takiego procesu wynosi od 60-70 godzin. Wydajność procesu może sięgać nawet 90%. Do głównych problemów prdukcji należą wysoka lepkość mieszaniny reakcyjnej, spowodowana ciągłym mieszaniem i napowietrzaniem, powodującym występowanie grzybni w formie kłębków lub rozgałęzionych strzępek. To z kolei powoduje że środowisko hodowlane osiąga bardzo dużą lepkość, co utrudnia wymianę masy i dyfuzję tlenu. Powstałe zawiesiny charakteryzują się właściwościami nienewtonowskimi i wymagają stosowania specjalnie projektowanych bioreaktorów.