Królestwo : Grzyby

Typ : Ascomycota

Podtyp : Ascomycotina

Rzad : Hypocreales

Rodzina : Hypocreaceae

Rodzaj : Acremonium

Tabela.1 Podstawowe informacje na temat Acremonium.

Łacińskie nazwy chorób wypisane w tabeli wyjaśnione w akapicie : Gdzie szukać aby znaleźć? Kiedy nie warto szukać i lepiej żeby nas samo nie znalazło.

Zdjęcie1. Acremonium sp.

Pobrano z http://www.emlab.com/app/fungi/Fungi.po?event=fungi&species=1&type=secondary

Zanim przystapimy do poszukiwań należy odpowiedzieć sobie na podstawowe pytanie : co chcemy osiagnąć za pomocą drobnoustroju. Jest to ważne pytanie ponieważ :

Rodzaj Acremonium zawiera w sobie około 100 gatunków, z których większość jest saprofityczna, wyizolowana z martwych szczątków organicznych oraz gleby, ze względu na swoją naturę mogą być związane z psuciem się pewnych produktów żywnościowych. Niektóre są organizmami oportunistycznymi bądź patogenami zwierząt i człowieka, mogą powodować : onychomycosis, keratitis, endophthalmitis, endocarditis, meningitis, peritonitis, osteomyelitis, mycetoma, oraz hyalohyphomycosis a odpowiedzialne za to są gatunki takie jak : A. falciforme, A. kiliense, A. recifei, A. alabamensis, A. potroni, A. roseo-griseum oraz A. strictum. Jedynie Acremonium chrysogenum = Cefalosporium acremonium wykorzystywany jest w przemyśle do produkcji cefalosporyny C.

Onychomycosis : grzybica paznokci

Keratitis : zapalanie rogówki oka

Endophthalmitis : zapalenie struktur wewnętrznych oka

Endocarditis : zapalenie wsierdzia zastawkowego

Meningitis : zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych

Peritonitis : zapalenie otrzewnej

Osteomyelitis : zapalenie kości - stan zapalny kości zbitej i gąbczastej

Mycetoma : (grzybica madurska) to ograniczony, przewlekły, ropiejący ziarniniak umiejscowiony w obrębie kończyn dolnych (stopy). Charakteryzuje się wytwarzaniem przetok wydzielających treść ropną.

Hyalohyphomycosis : Pod ta nazwą kryje się różnorodna (zależna od podatności pacjenta) mieszanka wyżej wymienionych stanów patologicznych.

Stąd jeśli z jakiś powodów zależy nam aby zdobyć któryś z patogenów (szaleńcy !!) to najlepiej udać się na odpowiedni oddział szpitalny, jeśli potrzebujemy grzyb saprofityczny to należało by odwiedzić firmę zajmujących technologią żywności natomiast jeśli jesteśmy naukowcami i zależy nam na produkcji cefalosporyny C to możemy obrać dwie drogi :

• Próbę izolacji szczepu ze środowiska; co będzie trudne, czaso i pracochłonne

lub

• Zajrzec na zamieszczony poniżej link, zadzwonić do odpowiedniej kolekcji szczepów i sobie grzybka zamówić.

http://wdcm.nig.ac.jp/STRAIN/fungi.xml?184

Konidia są to komórki służące grzybom do rozmnażania wegetatywnego, stanowią także formę spoczynkową tych organizmów. Charakteryzują się zmniejszoną zawartością wody oraz są w stanie metabolicznego uśpienia. Mogą one kiełkować, tworząc wegetatywną grzybnię. Początkowo grzybnia składa się z młodych, szybko rosnących i dzielących się komórek, które tworzą rozgałęzione układy. W miarę rozwoju tworzy się heterogeniczny układ metabolicznie nierównocennych komórek. W wyniku zmieniających się warunków środowiska, następuje morfologiczne i fizjologiczne różnicowanie komórek w kolonii, którego końcowym etapem jest sporulacja. Wyrastanie konidioforów jest zazwyczaj indukowane wyczerpaniem się składników azotowych pożywki. Układ konidialny jest bardzo zredukowany. Konidia mogą powstawać bezpośrednio na konidioforach będących pojedynczymi komórkami w bocznych odgałęzieniach strzępek grzybni.

Rys.1 Morfologia grzybni. A-stresfa wzrostu strzępki, B- nitkowata grzybnia rozgałęziona C- strefa wzrostu w kuleczce lub zwartym kłaczku grzybni.

Rys.2 Morfologia układów konidialnych wybranych gatunków grzybów strzępkowych.

Grzyby są organizmami najczęsciej wykorzystywanymi w produkcji antybiotyków, głównie ze względu na silne właściwości bakteriobójcze, jak i dobrą wydajność produkcji. W niniejszym opracowaniu skupiono się na produkcji cefalosporyny C przez grzyba Acremonium chrysogenum znanego również pod nazwą Cefalosporium acremonium. Sam antybiotyk choć ma słabe właściwości bakteriobójcze stanowi punkt wyjscia do syntezy znacznie silniejszych leków.

Specyficzne geny struktury kodujące enzymy swoiste dla szlaków, w których powstają idiolity, mogą być zlokalizowane w chromosomach lub w plazmidach. Informacja zawarta w genetycznych elementach pozachromosomowych dotyczy jednak najczęściej genów regulatorowych i mechanizmów kontrolujących transkrypcję specyficznych genów struktury. Geny biosyntezy cefalosporyny u Acremonium chrysogenum są zlokalizowane w dwóch miejscach chromosomu. Nawet w wypadku wspólnego umiejscowienia genów szlaku biosyntezy antybiotyku, geny te u grzybów mogą podlegać transkrypcji z udziałem odmiennych promotorów, a zamiast jednego operonu istnieje, kilka niezależnych jednostek transkrypcyjnych objętych odrębną regulacją ich ekspresji. Istnieje kilkanaście genów struktury dla cefalosporyny. Uważa się, że geny biosyntezy antybiotyków powstały w wyniku powielania i mutacji genów struktury enzymów metabolizmu podstawowego.

Wykryta w roku 1956 jako produkt metabolizmu grzyba Cephalosporium acremonium, nigdy nie była stosowana w antybiotykoterapii ze względu na zbyt małą aktywność przeciwbakteryjną. Produkt naturalny okazał się natomiast dogodnym punktem wyjścia do otrzymania cefalosporyn półsyntetycznych. Półproduktami do ich wytwarzania są:

1. kwas 7-aminocefalosporanowy (7-AC), uzyskiwany z cefalosporyny przez hydrolizę chemiczną wiązania amidowego
2. kwas 7-amino-3-deacetoksycefalosporanowy (7-ADC), otrzymywany z penicylin na drodze hydrolizy chemicznej lub transformacji łączonej-chemicznej i enzymatycznej
3. cefamycyna C, 7-alfa-metoksylowy analog cefalosporyn

Rys.3 Cefalosporyna C.

Bezpośrednim prekursorem wszystkich cefalosporyn jest izopenicylina N. Ulega ona izomeryzacji z udziałem epimerazy penicylinowej. zachodzi zmiana konfiguracji łańcucha bocznego L-alfa-AA do D-alfa-AA, a produktem jest penicylina N. W kolejnym etapie następuje ekspansja pierścienia tiazolidynowego do dihydrotiazynowego. Reakcja jest katalizowana przez syntetazę deacetoksycefalosporyny C. Powstaje deacetoksycefalosporyna C, która z udziałem specyficznej oksygenazy zostaje przekształcona do deacetylocefalosporyny C. Obydwie aktywności enzymatyczne są zlokalizowane w tym samym białku-produkcie pojedynczego genu. grupa hydroksymetylowa deacetylocefalosporyny ulega acetylacji z udziałem acetylotransferazy, w wyniku czego powstaje cefalosporyna C.

Biosynteza cefalosporyny C jest prowadzona w warunkach tlenowych w hodowli wgłębnej szczepów Acremonium chrysogenum . Podłoże kompleksowe zawiera cukry, pożywki azotowe, mączkę rybną oraz mikro- i makroelementy. Niezbędnym składnikiem jest L-metionina będąca prekursorem siarkowym. proces biosyntezy ma charakter dwufazowy i trwa 5-6 dób. Wzrost grzybni trwa do drugiej lub trzeciej doby procesu, podczas gdy synteza antybiotyku zachodzi gł. w trzeciej oraz czwartej dobie. Istotnym parametrem jest procesu, pozwalającym na jego śledzenie jest morfologia komórek szczepu produkcyjnego. W początkowym okresie widoczny jest intensywny wzrost grzybni nitkowatej. Wyczerpanie się glukozy w podłożu powoduje fragmentację strzępek. Sprzyja temu obecność L-metioniny w podłożu produkcyjnym. fragmentacja grzybni kończy się wytworzeniem jednokomórkowych artrospor, które mogą pęcznieć i kiełkować. Intensywna synteza cefalosporyny C zachodzi na etapie fragmentacji grzybni i występowania artrospor.

Cefalosporyna C ma charakter anionu, do jej wyodrębnienia i oczyszczenia stosuje się chromatografię jonowymienną z wykorzystaniem anionitów o różnej sile jonowej. Początkowe etapy wydzielania antybiotyku to zakwaszenie zawiesiny pofermentacyjnej kwasem octowym i oddzielenie grzybni na filtrze próżniowym. Jako pomoc filtracyjną stosuje się ziemię okrzemkową. Podczas biosyntezy powstaje również penicylina N, którą należy usunąć z przesączu pohodowlanego. W celu hydrolizy penicyliny N przesącz zakwasza się do pH 2-3 i przetrzymuje w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 3h. Roztwór pozbawiony produktu ubocznego schładza się do 0 stopni Celsjusza i podaje się na kolumnę z silnie zasadowym anionitem, na której usuwane są zanieczyszczenia anionowe, a następnie na kolumnę z anionitem słabo zasadowym w celu związania cefalosporyny. antybiotyk wymywa się z kolumny roztworem kwasu octowego z pirydyną i po zatężeniu eluatu wytrąca się cefakosporynę C bezwodnym acetonem. Dalsze oczyszczanie produktu biosyntezy prowadzi się na drodze krystalizacji, przy czym resztki pirydyny usuwa się wcześniej na kolumnie z kationitem sulfonowym.

Rys.4 Schemat wyodrębniania i oczyszczania cefalosporyny C.

Możliwe jest otrzymywanie półsyntetycznych cefalosporyn gdzie, na drodze chemicznej modyfikacji półproduktu otrzymanego z pomocą mikroorganizmów otrzymuje sie nowe jeszcze skuteczniejsze leki.

Przykładem wytwarzania cefalosporyn półsyntetycznych jest synteza cefamandolu z kwasu 7-AC. W pierwszym etapie tej syntezy kwas 7-AC poddaje się działaniu słabej zasady heterocyklicznej, dzięki czemu powstaje cefalosporyna przejściowa, zmodyfikowana w pozycji C-3. W drugim etapie zabezpiecza się grupę karboksylową i aminową otrzymanego produktu pośredniego przez sililowanie za pomocą BSA w octanie etylu. Uzyskane połączenie poddaje się acylacji chlorkiem kwasu O-formylo-D-migdałowego. W ostatnim etapie usuwa się oba sililowe ugrupowania ochronne i otrzymuje się sól sodową mrówczanu cefamandolu-cefamandol nafate. In vivo hydrolizuje do cefamandolu, będącego właściwym lekiem.

Rys.5 Zarys syntezy cefamandolu z kwasu 7-AC i kwasu migdałowego.

Innym przykładem syntezy podwójnie zmodyfikowanej cefalosporyny jest otrzymywanie cefaleksyny, możliwie dwiema metodami. Pierwsza z nich wywodzi się z estru kwasu 7-ADC. Końcowym etapem jest usuwanie ugrupowań ochronnych. W drugiej metodzie surowcem jest penicylina V. Najpierw prowadzi się przekształcenie układu penamowego w cefemowy, a następnie transacylację otrzymanej pochodnej kwasu 7-ADC w pozycji C-7. W każdej z metod używa się inncyh ugrupowań ochronnych oraz odmiennych metod ich eliminacji.

Rys.6 Zarys otrzymywania cefaleksyny z estru metylowego kwasu 7-ADC.

Rys.7 Synteza cefaleksyny z penicyliny V.

Jon fosforanowy należy do zasadniczych składników podłoży hodowlanych. Jest on używany w syntezie mało- i wielocząsteczkowych komponentów materiału komórkowego oraz stanowi ważny czynnik ufosforylowanych metabolitów, które są podstawowymi efektorami metabolicznymi kontrolującymi zarówno procesy degradacyjne, jak i związane z syntezami komórkowymi.Poza regulacją fosforanową o charakterze ogólnometabolicznym, możliwa jest również lokalna regulacja w obrębie specyficznych szlaków biosyntezy, w których efektorem metabolicznym jest PO43-. W procesie syntezy cefalosporyny C u Cefalosporium acremonium niekorzystny wpływ PO43- w stężeniu > 2,75 mmol/l polega na zwiększeniu szybkości przyswajania glukozy i powodowaniu regulacji katabolicznej.

Jak powszechnie wiadomo źródło węgla jest jednym z najważniejszych jak nie najważniejszym czynnikiem wpływającym na wzrost drobnoustrojów oraz produkcję przez nie ważnych z punktu widzenia przemysłu metabolitów. Aby mogła rozpocząć się synteza enzymów biorących udział w produkcji metabolitów wtórnych często wymagane jest zniesienie ogólnometabolicznego układu represji katabolicznej. Pierwotnie zjawisko to określano jako „efekt glukozowy”. Zaznaczyc należy, że nie jest on związany z rodzajem zastosowanego źródła węgla lecz szybkością z jaka jest on zużywany co z kolei powiązane jest z produkcją energii metabolicznej i związków pośrednich biorących udział we właściwej produkcji. Sytuację taką zaobserwowano podczas syntezy cefalosporyny C przez A. chrysogenum. W obecności samej glukozy w pożywce grzyb szybko się namnażał jednak nie produkował antybiotyku ( blokada szlaku metabolicznego). Naukowcy w myśl zasady : „ Nie ma tego złego, co by na dobre nie wyszło” bardzo sprytnie ten problem rozwiązali. Otóż zastosowali pożywkę zawierającą glukozę oraz sacharozę. Glukoza zapewniła szybki przyrost biomasy, a gdy jej zabrakło grzyb rozpoczął wolniejsze zużywanie sacharozy przy którym nastąpiła efektowna produkcja antybiotyku. Podobny efekt uzyskano gdy glukoza była podawana do podłoża małymi porcjami. Mechanizm represji katabolicznej występuje w wielu przypadkach biosyntezy metabolitów specyficznych. W badaniach nad produkcją cefalosporyny C naukowcom udało się dowiedzeć, że represji katabolicznej ulega synteza deacetoksycefalosporyny C (tzw. „ekspandaza”). Stąd w początkowym etapie produkcji w podłożu znajdzie się prekursor cefalosporyny C – penicylina N a dopiero po wyczerpaniu glukozy nastąpi jego przekształcenie we właściwy antybiotyk. Hamująco na tym samym etapie szlaku co glukoza działa również jon amonowy NH4+ ( należy stosować pożywki z brakiem lub znikomą ilością tego jonu).

Rys.8 Miejsce represji katabolicznej ze strony glukozy oraz represji jonem amonowym w szlaku biosyntezy cefalosporyny C u Cephalosporium acremonium.

Dla zapewnienia efektywnej produkcji cefalosporyny C u C.acremonium niezbędna jest akumulacja w komórkach metioniny endo bądź egzogennej w okresie poprzedzającym właściwą produkcję antybiotyku. Doskonałym w syntezie cefalosporyny C okazał się mutant C.acremonium oporny na DL-selenometioninę. Już od samego początku jego hodowli można było zauważyc nadprodukcję L-metioniny. Silna stymulacja była również obserwowana gdy podłoże fermentacyjne zawierało DL-cysteinę lub jej analog DL-norleucynę- ten związek jest donorem siarki podczas syntezy antybiotyku.

Od lat stosuje się krzyżowanie szczepów przez fuzję protoplastów. W ten sposób zostały wytworzone najlepsze obecnie szczepy przemysłowe do produkcji antybiotyków. Rekombinacja genetyczna przez fuzję drobnoustrojów dała dobre wyniki, szczególnie w zakresie zwiększenia wydajności produktów. U Acremonium chrysogenum uzyskano w ten sposób wzrost wydajności produkcji cefalosporyny o 40%. Grzyby stosowane do biosyntezy antybiotyków nie mają w swoim cyklu rozwojowym etapu rozmnażania płciowego. Do ich krzyżowania można wykorzystać cykl paraseksualny. Podczas hodowli grzybni wegetatywnej dwóch haploidalnych szczepów może dochodzić między nimi do plazmogamii, w efekcie powstają komórki heterokariotyczne. Następny etap, równie rzadki polega na zlewaniu się jąder-kariogamii, dzięki czemu powstają komórki diploidalne. Znaczenie biotechnologiczne ma możliwość wystąpienia mitotycznej rekombinacji genetycznej i wytworzenie diploidalnych rekombinantów. Końcowym etapem jest segregacja materiału genetycznego i haploidyzacja, w wyniku czego otrzymuje się haploidalne rekombinanty o zmodyfikowanym zestawie genów. Przeprowadzono doświadczenie podczas którego skrzyżowano protoplasty dwóch szczepów Acremonium chrysogenum produkujących cefalosporynę C. Jeden z nich był wysoko wydajny, ale rosnął wolno i nie wytwarzał spor, natomiast drugi miał właściwości odwrotne. Otrzymano mieszańca, który łączył w sobie cechy szybkiego wzrostu, dobrej sporulacji oraz dużej wydajności produkcji antybiotyku. Wytwarzał cefalosporynę C z wydajnością o 40% większą aniżeli lepszy ze szczepów rodzicielskich.

„Biotechnologia i chemia antybiotyków” Aleksander Chmiel i Stefan Grudziński, Wydawnictwo naukowe PWN Z książki tej pochodzą rysunki nr. 1, 2, 4, 5, 6, 7

„Biotechnologia podstawy mikrobiologiczne i biochemiczne” Aleksander Chmiel, Wydawnictwo naukowe PWN. Z książki tej pochodzą rysunki nr. 3, 8

http://www.emlab.com/app/fungi/Fungi.po?event=fungi&species=1&type=secondary

http://www.mycology.adelaide.edu.au/Fungal_Descriptions/Hyphomycetes_(hyaline)/Acremonium/

http://www.doctorfungus.org/thefungi/Acremonium.htm

http://en.wikipedia.org/wiki/Acremonium

Zdjęcie.2 Różnorodność sosów sojowych.

Sos sojowy jest jedną z najstarszych przypraw świata i został wyprodukowany ponad 2500 lat temu w Chinach. Jest on otrzymywany tradycyjną metodą w wyniku poddania fermentacji mieszanki tłuczonej soi, soli i enzymów - proces ten trwa od 6 miesięcy do 2 lat. Jest on również otrzymywany sztucznie poprzez proces chemiczny przy użyciu specjalnego koncentratu - proces ten trwa 3 dni. Sos sojowy został wykorzystany do wzmocnienia smaku wielu rodzajów żywności.

Zdjęcie.3 Sosy sojowe.

Zostały określone jako „król roślin strączkowych” ze względu na ich cenne właściwości odżywcze. Spośród wszystkich fasoli, nasiona soi zawierają najwięcej wysokowartościowego biologicznie białka roślinnego, o odpowiednim dla człowieka składzie aminokwasowym. Są one również bogate w tłuszcze oraz minerały, zwłaszcza wapń i magnez oraz witaminy z grupy B. Owłosione strąki zawierają dwa lub trzy nasiona, które mogą być małe i okrągłe lub większe i bardziej wydłużone. Ich kolor zmienia się od żółto-brązowego, poprzez zielony do czarnego. Nasiona soi są bardzo ważnym surowcem do produkcji pasz i stanowią również cenny pokarm dla człowieka. Soja jest produktem bezglutenowym o właściwościach antymiażdżycowych, podwyższających odporność organizmu. W sosie sojowym nasiona soi są tłuczone przed ich mieszaniem z innymi składnikami.

Zdjęcie.4 Nasiona soi.

Pszenica jest dodawana do zacieru zgniecionych nasion soi. W wielu recepturach pszenica jest mieszana w równych proporcjach z soją - np. ciemny sos Koikuch, albo w mniejszych - np. bardzo ciemny sos Tamari, lub większych - np. biały sos Shiro.

Soli lub chlorku sodu dodaje się na początku fermentacji. Sól jest nie tylko dodawana do smaku, ale również pomaga ustanowić właściwe środowisko chemiczne dla bakterii fermentacji mlekowej i drożdży. Wysokie stężenie soli jest również konieczne, aby pomóc w ochronie gotowego produktu przed zepsuciem.

Mieszanka soi i pszenicy poddawana jest działaniu szczepów pleśni o nazwie Aspergillus oryzae lub Aspergillus soyae, które rozkładają białka w zacierze. Dalsza fermentacja następuje poprzez dodanie bakterii fermentacji mlekowej (Pediococcus halophilus) i drożdży.

Benzoesan sodu lub kwas benzoesowy są dodawane w celu powstrzymania rozwoju mikroorganizmów w gotowych sosach sojowych. Metoda chemiczna wymaga dodania dodatkowych agentów koloru i smaku.

Tradycyjna metoda otrzymywania sosu sojowego, składa się z trzech etapów: Koji, fermentacja i pasteryzacja.

Jaka jest różnica między Koji a kulturami Koji? Powszechnie przyjmuje się że Koji jest to mieszanina zawierająca soję, pszenicę, wodę oraz kultury Koji czyli wyselekcjonowane szczepy Aspergillus oryzae lub Aspergillus soyae. W niektórych źródłach można znaleźc informacje że Koji to same szczepy Aspergillus niestety nazwa Koji jest często używana naprzemiennie dla obu przypadków a jej znaczenie zależy od kontekstu zdania.

Starannie wyselekcjonowane nasiona soi i pszenicy (lub prażony ryż) są kruszone i mieszane razem w warunkach kontrolowanych. Do mieszaniny dodawana jest woda, która jest gotowana z ziarnami do momentu ich ugotowania i zmiękczenia. Dzięki temu białko łatwiej rozkłada się na aminokwasy. Etap ten pełni również funkcję sterylizacji. Zacier jest pozostawiony do ostygnięcia do około 27°C przed dodaniem Aspergillus. Po dodaniu grzyba mieszanina jest odstawiona na trzy dni, w celu dojrzewania, w dużych perforowanych kadziach, za pośrednictwem których rozprowadzane jest powietrze, podczas tego procesu następuje fermentacja tlenowa.W Koji zawierte są duże ilości bardzo wydajnych enzymów katalitycznych, m.in. alfa-amylazę [Alfa-amylaza rozbija wiązanie α(1-4)glikozydowe amylozy dając cząsteczki maltozy (disacharydy α-glukozy)], enzymy proteolityczne (rozkładają białka z soi). Inne enzymy które można znaleź w Koji to m.in. ; sulfatazy, nukleazy, fosfatazy, transglikozydazy, acylazy, depolimerazy-rybonukleotydów.

Koji jest przekazywany do zbiorników fermentacyjnych, gdzie jest mieszany z wodą i solą (24% NaCl) w celu produkcji zacieru o nazwie moromi. Bakterie fermentacji mlekowej (Pediococcus halophilus) są odporne na wysokie stężenie soli, dodane do moromi rozpoczynają proces fermentacji beztlenowej w wyniku którego z glukozy powstaje kwas mlekowy. Kwas ten obniża pH moromi do około 5. Takie warunki z kolei są optymalne dla drożdży Candida i/lub Zygosaccharomyces rouxii które rozpoczynają proces fermentacji alkoholowej. Moromi musi fermentować przez kilka miesięcy, podczas których klej z soi i pszenicy zamienia się w pół-płynny, czerwonawo-brązowy „dojrzały zacier”. Ten proces fermentacji tworzy ponad 200 różnych związków smaku i zapachu np.

Związki smakowe : peptydy, aminokwasy [m.in. kwas glutaminowy (działa jako wzmacniacz smaku), kwas asparaginowy, lizyna, alanina, glicyna, tryptofan], cukry (głównie glukoza), alkohole (m.in. etanol i alkohol izoamylowy), kwasy organiczne m.in. kwas mlekowy i bursztynowy (działają jako dodatki smakowe, ale także jako konserwanty), estry.

Związki zapachowe : częśc aminokwasów i cukrów redukujących przechodzi reakcję Maillarda [http://pl.wikipedia.org/wiki/Reakcja_Maillarda] dając m.in. pirazyny związki o bardzo charakterystycznym zapachu chleba, krakersów orzeszków dodatkowo można wyróżnic takie związki zapachowe jak : ang. 2-phenylethanol, 3-(methylsulfanyl)propanal (methional), tautomery 4-hydroxy-5-ethyl-2-methyl- i 4-hydroxy-2-ethyl-5-methyl-3(2H)-furanone (4-HEMF), 4-hydroxy-2,5-dimethyl-3(2H)-furanone (4-HDF), i 3-hydroxy-4,5-dimethyl-2(5H)-furanone (sotolone). Ponadto 3-methylbutanal (słodowy), 4-HEMF (przypominający karmel), 2-methylbutanal (słodowy), methional (gotowanych ziemniaków), i ethyl 2-methylpropanoate (owocowy).

Zdjecie.5 Fermentacja.

Po około sześciu miesiącach (do 2 lat) od fermentacji, surowy sos sojowy jest oddzielany od pozostałości ciasta z pszenicy i soi przez naciśnięcie go szmatką z warstw filtracyjnych. Płyn, który wyłania się jest następnie pasteryzowany. Pasteryzacja procesu pomaga przedłużyć okres ważności produktu gotowego, sos sojowy staje się przejrzysty i zyskuje na aromacie. Wreszcie, jako ciecz sos sojowy jest butelkowany.

Rys.9 Krótki schemat produkcji sosu sojowego.

W tej metodzie zamiast fermentacji, doprowadza się do sztucznego rozbicia białek sojowych przez proces chemiczny znany jako hydrolizą. Proces ten zachodzi o wiele szybciej niż tradycyjny proces produkcji sosu sojowego.

• 1. W tej metodzie, nasiona soi są gotowane w kwasie solnym w wysokiej temperaturze pod ciśnieniem do 15-20 godzin, w celu utworzenia hydrolizowanego białka roślinnego. Następnie mieszanina jest schładzana, aby zatrzymać reakcję hydrolityczną.
• 2. Ciecz jest neutralizowana i oczyszczana przez filtrację.
• 3. Sól, karmel, chemiczne konserwatory i środki aromatyzujące są dodawane do tej mieszanki w celu uzyskania odpowiedniego koloru i smaku. Mieszanina jest następnie rafinowana i pakowana.

Sosy produkowane przez chemiczne metody są ostrzejsze w smaku, jak te produkowane w tradycyjny sposób. Zawierają również domieszkę alkoholu, dodawanego w celu uchronienia produktu przed zepsuciem. W 2001 roku w Wielkiej Brytanii Agencja Standardów Żywności (FSA) testowała różne sosy sojowe produkowane tą metodą. Wykryto w nich wysoki poziom toksycznego 3-MCPD. Metodą tradycyjną wytwarza się obecnie jedynie około 1% sosów sojowych.

www.clearspring.co.uk Ze strony tej pochodzą zdjęcia nr. 2, 3, 4, 5 oraz rysunek nr. 9

www.answers.com

http://pubs.acs.org/cgi-bin/abstract.cgi/jafcau/2007/55/i15/abs/jf0709092.html

http://www.kikkomanusa.com/_pages/manufacturer/basics/characterising_soy.asp?loc=103&subsection=basics&subsection2=characterizing