====== Acremonium (Cephalosporium) + Produkcja antybiotyków z zastosowaniem tego rodzaju ====== ===== Systematyka i ogólna charakterystyka rodzaju Acremonium ===== Królestwo : Grzyby Typ : //Ascomycota// Podtyp : //Ascomycotina// Rzad : //Hypocreales// Rodzina : //Hypocreaceae// Rodzaj : //Acremonium// || **Występowanie** | **Gdzie można znaleźć** | **Metoda rozprzestrzeniania** || || Wszechobecny;kosmopolityczny około 100 gatunków. | Gleba, martwe szczątki organiczne, siano, produkty żywnościowe. | Zarodniki roznoszone przez owady, krople wody, wiatr. || || **Alergeny** | **Patogeniczność** | **Produkcja toksyn/antybiotyków** || || Alergeny typu I (katar sienny, astma) Alergeny typu III (hypersensitivity pneumonitis –alergiczne zapalenie oskrzelików płucnych).| Najczęściej : Mycetoma, keratitis, onychomycosis. Inne infekcje rzadko spotykane; jedynie u pacjentów z niedoborem odporności i osób z głębokimi ranami. Większość szczepów //Acremonium// za wyjątkiem patogenów nie rośnie lub ginie w temp. powyżej 37ºC | Cefalosporyna || || **Warunki wzrostu** | **Znaczenie dla przemysłu** | **Dodatkowy komentarz** || || Temperatura : 15ºC (gatunki glebowe) do 37ºC (patogeny). Wymagają dużej wilgotności. | Produkcja cefalosporyny | Dawna nazwa rodzajowa : Cefalosporium – ciągle jest w użyciu. || || **Charakterystyka wzrostu** | **Rozpoznawanie spor** | **Współwystępowanie z :** || || Dobry wzrost na większości podłoży do hodowli grzybów. Drobne białe, blado-różowe kolonie, błoniaste lub cienkie, aksamitne. | Mało charakterystyczne. Małe jednokomórkowe, białe | Często z //Stachybotrys//. || **Tabela.1 Podstawowe informacje na temat //Acremonium//.** **Łacińskie nazwy chorób wypisane w tabeli wyjaśnione w akapicie : Gdzie szukać aby znaleźć? Kiedy nie warto szukać i lepiej żeby nas samo nie znalazło.** {{grupa11:acre_1.jpg|}} **Zdjęcie1. //Acremonium sp//.** **Pobrano z http://www.emlab.com/app/fungi/Fungi.po?event=fungi&species=1&type=secondary** ===== Gdzie szukać aby znaleźć? Kiedy nie warto szukać i lepiej żeby nas samo nie znalazło. ===== **Zanim przystapimy do poszukiwań należy odpowiedzieć sobie na podstawowe pytanie : co chcemy osiagnąć za pomocą drobnoustroju. Jest to ważne pytanie ponieważ :** Rodzaj Acremonium zawiera w sobie około 100 gatunków, z których większość jest saprofityczna, wyizolowana z martwych szczątków organicznych oraz gleby, ze względu na swoją naturę mogą być związane z psuciem się pewnych produktów żywnościowych. Niektóre są organizmami oportunistycznymi bądź patogenami zwierząt i człowieka, mogą powodować : onychomycosis, keratitis, endophthalmitis, endocarditis, meningitis, peritonitis, osteomyelitis, mycetoma, oraz hyalohyphomycosis a odpowiedzialne za to są gatunki takie jak : A. falciforme, A. kiliense, A. recifei, A. alabamensis, A. potroni, A. roseo-griseum oraz A. strictum. Jedynie Acremonium chrysogenum = Cefalosporium acremonium wykorzystywany jest w przemyśle do produkcji cefalosporyny C. Onychomycosis : grzybica paznokci Keratitis : zapalanie rogówki oka Endophthalmitis : zapalenie struktur wewnętrznych oka Endocarditis : zapalenie wsierdzia zastawkowego Meningitis : zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych Peritonitis : zapalenie otrzewnej Osteomyelitis : zapalenie kości - stan zapalny kości zbitej i gąbczastej Mycetoma : (grzybica madurska) to ograniczony, przewlekły, ropiejący ziarniniak umiejscowiony w obrębie kończyn dolnych (stopy). Charakteryzuje się wytwarzaniem przetok wydzielających treść ropną. Hyalohyphomycosis : Pod ta nazwą kryje się różnorodna (zależna od podatności pacjenta) mieszanka wyżej wymienionych stanów patologicznych. Stąd jeśli z jakiś powodów zależy nam aby zdobyć któryś z patogenów (szaleńcy !!) to najlepiej udać się na odpowiedni oddział szpitalny, jeśli potrzebujemy grzyb saprofityczny to należało by odwiedzić firmę zajmujących technologią żywności natomiast jeśli jesteśmy naukowcami i zależy nam na produkcji cefalosporyny C to możemy obrać dwie drogi : * Próbę izolacji szczepu ze środowiska; co będzie trudne, czaso i pracochłonne lub * Zajrzec na zamieszczony poniżej link, zadzwonić do odpowiedniej kolekcji szczepów i sobie grzybka zamówić. http://wdcm.nig.ac.jp/STRAIN/fungi.xml?184 ==== Cykl rozwojowy Acremonium na przykładzie Acremonium chrysogenum ==== Konidia są to komórki służące grzybom do rozmnażania wegetatywnego, stanowią także formę spoczynkową tych organizmów. Charakteryzują się zmniejszoną zawartością wody oraz są w stanie metabolicznego uśpienia. Mogą one kiełkować, tworząc wegetatywną grzybnię. Początkowo grzybnia składa się z młodych, szybko rosnących i dzielących się komórek, które tworzą rozgałęzione układy. W miarę rozwoju tworzy się heterogeniczny układ metabolicznie nierównocennych komórek. W wyniku zmieniających się warunków środowiska, następuje morfologiczne i fizjologiczne różnicowanie komórek w kolonii, którego końcowym etapem jest sporulacja. Wyrastanie konidioforów jest zazwyczaj indukowane wyczerpaniem się składników azotowych pożywki. Układ konidialny jest bardzo zredukowany. Konidia mogą powstawać bezpośrednio na konidioforach będących pojedynczymi komórkami w bocznych odgałęzieniach strzępek grzybni. {{grupa11:1.jpg|}} **Rys.1 Morfologia grzybni. A-stresfa wzrostu strzępki, B- nitkowata grzybnia rozgałęziona C- strefa wzrostu w kuleczce lub zwartym kłaczku grzybni.** {{grupa11:2.jpg|}} **Rys.2 Morfologia układów konidialnych wybranych gatunków grzybów strzępkowych.** ===== Produkcja antybiotyków ===== Grzyby są organizmami najczęsciej wykorzystywanymi w produkcji antybiotyków, głównie ze względu na silne właściwości bakteriobójcze, jak i dobrą wydajność produkcji. W niniejszym opracowaniu skupiono się na produkcji cefalosporyny C przez grzyba //Acremonium chrysogenum// znanego również pod nazwą //Cefalosporium acremonium//. Sam antybiotyk choć ma słabe właściwości bakteriobójcze stanowi punkt wyjscia do syntezy znacznie silniejszych leków. ==== Genetycznie uwarunkowana biosynteza antybiotyków ==== Specyficzne geny struktury kodujące enzymy swoiste dla szlaków, w których powstają idiolity, mogą być zlokalizowane w chromosomach lub w plazmidach. Informacja zawarta w genetycznych elementach pozachromosomowych dotyczy jednak najczęściej genów regulatorowych i mechanizmów kontrolujących transkrypcję specyficznych genów struktury. Geny biosyntezy cefalosporyny u //Acremonium chrysogenum// są zlokalizowane w dwóch miejscach chromosomu. Nawet w wypadku wspólnego umiejscowienia genów szlaku biosyntezy antybiotyku, geny te u grzybów mogą podlegać transkrypcji z udziałem odmiennych promotorów, a zamiast jednego operonu istnieje, kilka niezależnych jednostek transkrypcyjnych objętych odrębną regulacją ich ekspresji. Istnieje kilkanaście genów struktury dla cefalosporyny. Uważa się, że geny biosyntezy antybiotyków powstały w wyniku powielania i mutacji genów struktury enzymów metabolizmu podstawowego. ==== Cefalosporyna C ==== Wykryta w roku 1956 jako produkt metabolizmu grzyba //Cephalosporium acremonium//, nigdy nie była stosowana w antybiotykoterapii ze względu na zbyt małą aktywność przeciwbakteryjną. Produkt naturalny okazał się natomiast dogodnym punktem wyjścia do otrzymania cefalosporyn półsyntetycznych. Półproduktami do ich wytwarzania są: - kwas 7-aminocefalosporanowy (7-AC), uzyskiwany z cefalosporyny przez hydrolizę chemiczną wiązania amidowego - kwas 7-amino-3-deacetoksycefalosporanowy (7-ADC), otrzymywany z penicylin na drodze hydrolizy chemicznej lub transformacji łączonej-chemicznej i enzymatycznej - cefamycyna C, 7-alfa-metoksylowy analog cefalosporyn {{grupa11:cefalosporyna_c.jpg|}} **Rys.3 Cefalosporyna C.** ==== Biogeneza cefalosporyn ==== Bezpośrednim prekursorem wszystkich cefalosporyn jest izopenicylina N. Ulega ona izomeryzacji z udziałem epimerazy penicylinowej. zachodzi zmiana konfiguracji łańcucha bocznego L-alfa-AA do D-alfa-AA, a produktem jest penicylina N. W kolejnym etapie następuje ekspansja pierścienia tiazolidynowego do dihydrotiazynowego. Reakcja jest katalizowana przez syntetazę deacetoksycefalosporyny C. Powstaje deacetoksycefalosporyna C, która z udziałem specyficznej oksygenazy zostaje przekształcona do deacetylocefalosporyny C. Obydwie aktywności enzymatyczne są zlokalizowane w tym samym białku-produkcie pojedynczego genu. grupa hydroksymetylowa deacetylocefalosporyny ulega acetylacji z udziałem acetylotransferazy, w wyniku czego powstaje cefalosporyna C. ==== Biosynteza i wyodrębnienie cefalosporyny C ==== Biosynteza cefalosporyny C jest prowadzona w warunkach tlenowych w hodowli wgłębnej szczepów //Acremonium chrysogenum// . Podłoże kompleksowe zawiera cukry, pożywki azotowe, mączkę rybną oraz mikro- i makroelementy. Niezbędnym składnikiem jest L-metionina będąca prekursorem siarkowym. proces biosyntezy ma charakter dwufazowy i trwa 5-6 dób. Wzrost grzybni trwa do drugiej lub trzeciej doby procesu, podczas gdy synteza antybiotyku zachodzi gł. w trzeciej oraz czwartej dobie. Istotnym parametrem jest procesu, pozwalającym na jego śledzenie jest morfologia komórek szczepu produkcyjnego. W początkowym okresie widoczny jest intensywny wzrost grzybni nitkowatej. Wyczerpanie się glukozy w podłożu powoduje fragmentację strzępek. Sprzyja temu obecność L-metioniny w podłożu produkcyjnym. fragmentacja grzybni kończy się wytworzeniem jednokomórkowych artrospor, które mogą pęcznieć i kiełkować. Intensywna synteza cefalosporyny C zachodzi na etapie fragmentacji grzybni i występowania artrospor. ==== Wyodrębnienie produktu ==== Cefalosporyna C ma charakter anionu, do jej wyodrębnienia i oczyszczenia stosuje się chromatografię jonowymienną z wykorzystaniem anionitów o różnej sile jonowej. Początkowe etapy wydzielania antybiotyku to zakwaszenie zawiesiny pofermentacyjnej kwasem octowym i oddzielenie grzybni na filtrze próżniowym. Jako pomoc filtracyjną stosuje się ziemię okrzemkową. Podczas biosyntezy powstaje również penicylina N, którą należy usunąć z przesączu pohodowlanego. W celu hydrolizy penicyliny N przesącz zakwasza się do pH 2-3 i przetrzymuje w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 3h. Roztwór pozbawiony produktu ubocznego schładza się do 0 stopni Celsjusza i podaje się na kolumnę z silnie zasadowym anionitem, na której usuwane są zanieczyszczenia anionowe, a następnie na kolumnę z anionitem słabo zasadowym w celu związania cefalosporyny. antybiotyk wymywa się z kolumny roztworem kwasu octowego z pirydyną i po zatężeniu eluatu wytrąca się cefakosporynę C bezwodnym acetonem. Dalsze oczyszczanie produktu biosyntezy prowadzi się na drodze krystalizacji, przy czym resztki pirydyny usuwa się wcześniej na kolumnie z kationitem sulfonowym. {{grupa11:6.jpg|}} **Rys.4 Schemat wyodrębniania i oczyszczania cefalosporyny C.** ==== Synteza cefalosporyn ==== Możliwe jest otrzymywanie półsyntetycznych cefalosporyn gdzie, na drodze chemicznej modyfikacji półproduktu otrzymanego z pomocą mikroorganizmów otrzymuje sie nowe jeszcze skuteczniejsze leki. Przykładem wytwarzania cefalosporyn półsyntetycznych jest synteza cefamandolu z kwasu 7-AC. W pierwszym etapie tej syntezy kwas 7-AC poddaje się działaniu słabej zasady heterocyklicznej, dzięki czemu powstaje cefalosporyna przejściowa, zmodyfikowana w pozycji C-3. W drugim etapie zabezpiecza się grupę karboksylową i aminową otrzymanego produktu pośredniego przez sililowanie za pomocą BSA w octanie etylu. Uzyskane połączenie poddaje się acylacji chlorkiem kwasu O-formylo-D-migdałowego. W ostatnim etapie usuwa się oba sililowe ugrupowania ochronne i otrzymuje się sól sodową mrówczanu cefamandolu-cefamandol nafate. In vivo hydrolizuje do cefamandolu, będącego właściwym lekiem. {{grupa11:3.jpg|}} **Rys.5 Zarys syntezy cefamandolu z kwasu 7-AC i kwasu migdałowego.** Innym przykładem syntezy podwójnie zmodyfikowanej cefalosporyny jest otrzymywanie cefaleksyny, możliwie dwiema metodami. Pierwsza z nich wywodzi się z estru kwasu 7-ADC. Końcowym etapem jest usuwanie ugrupowań ochronnych. W drugiej metodzie surowcem jest penicylina V. Najpierw prowadzi się przekształcenie układu penamowego w cefemowy, a następnie transacylację otrzymanej pochodnej kwasu 7-ADC w pozycji C-7. W każdej z metod używa się inncyh ugrupowań ochronnych oraz odmiennych metod ich eliminacji. {{grupa11:4.jpg|}} **Rys.6 Zarys otrzymywania cefaleksyny z estru metylowego kwasu 7-ADC.** {{grupa11:5.jpg|}} **Rys.7 Synteza cefaleksyny z penicyliny V.** ==== Regulacja produkcji cefalosporyny C ==== === Jon fosforanowy === Jon fosforanowy należy do zasadniczych składników podłoży hodowlanych. Jest on używany w syntezie mało- i wielocząsteczkowych komponentów materiału komórkowego oraz stanowi ważny czynnik ufosforylowanych metabolitów, które są podstawowymi efektorami metabolicznymi kontrolującymi zarówno procesy degradacyjne, jak i związane z syntezami komórkowymi.Poza regulacją fosforanową o charakterze ogólnometabolicznym, możliwa jest również lokalna regulacja w obrębie specyficznych szlaków biosyntezy, w których efektorem metabolicznym jest PO43-. W procesie syntezy cefalosporyny C u Cefalosporium acremonium niekorzystny wpływ PO43- w stężeniu > 2,75 mmol/l polega na zwiększeniu szybkości przyswajania glukozy i powodowaniu regulacji katabolicznej. === Regulacja kataboliczna źródłem węgla === Jak powszechnie wiadomo źródło węgla jest jednym z najważniejszych jak nie najważniejszym czynnikiem wpływającym na wzrost drobnoustrojów oraz produkcję przez nie ważnych z punktu widzenia przemysłu metabolitów. Aby mogła rozpocząć się synteza enzymów biorących udział w produkcji metabolitów wtórnych często wymagane jest zniesienie ogólnometabolicznego układu represji katabolicznej. Pierwotnie zjawisko to określano jako „efekt glukozowy”. Zaznaczyc należy, że nie jest on związany z rodzajem zastosowanego źródła węgla lecz szybkością z jaka jest on zużywany co z kolei powiązane jest z produkcją energii metabolicznej i związków pośrednich biorących udział we właściwej produkcji. Sytuację taką zaobserwowano podczas syntezy cefalosporyny C przez //A. chrysogenum//. W obecności samej glukozy w pożywce grzyb szybko się namnażał jednak nie produkował antybiotyku ( blokada szlaku metabolicznego). Naukowcy w myśl zasady : „ Nie ma tego złego, co by na dobre nie wyszło” bardzo sprytnie ten problem rozwiązali. Otóż zastosowali pożywkę zawierającą glukozę oraz sacharozę. Glukoza zapewniła szybki przyrost biomasy, a gdy jej zabrakło grzyb rozpoczął wolniejsze zużywanie sacharozy przy którym nastąpiła efektowna produkcja antybiotyku. Podobny efekt uzyskano gdy glukoza była podawana do podłoża małymi porcjami. Mechanizm represji katabolicznej występuje w wielu przypadkach biosyntezy metabolitów specyficznych. W badaniach nad produkcją cefalosporyny C naukowcom udało się dowiedzeć, że represji katabolicznej ulega synteza deacetoksycefalosporyny C (tzw. „ekspandaza”). Stąd w początkowym etapie produkcji w podłożu znajdzie się prekursor cefalosporyny C – penicylina N a dopiero po wyczerpaniu glukozy nastąpi jego przekształcenie we właściwy antybiotyk. Hamująco na tym samym etapie szlaku co glukoza działa również jon amonowy NH4+ ( należy stosować pożywki z brakiem lub znikomą ilością tego jonu). {{grupa11:blok_metaboliczny.jpg|}} **Rys.8 Miejsce represji katabolicznej ze strony glukozy oraz represji jonem amonowym w szlaku biosyntezy cefalosporyny C u //Cephalosporium acremonium//.** === Indukcja substratowa === Dla zapewnienia efektywnej produkcji cefalosporyny C u C.acremonium niezbędna jest akumulacja w komórkach metioniny endo bądź egzogennej w okresie poprzedzającym właściwą produkcję antybiotyku. Doskonałym w syntezie cefalosporyny C okazał się mutant //C.acremonium// oporny na DL-selenometioninę. Już od samego początku jego hodowli można było zauważyc nadprodukcję L-metioniny. Silna stymulacja była również obserwowana gdy podłoże fermentacyjne zawierało DL-cysteinę lub jej analog DL-norleucynę- ten związek jest donorem siarki podczas syntezy antybiotyku. === Fuzja protoplastów Acremonium chrysogenum === Od lat stosuje się krzyżowanie szczepów przez fuzję protoplastów. W ten sposób zostały wytworzone najlepsze obecnie szczepy przemysłowe do produkcji antybiotyków. Rekombinacja genetyczna przez fuzję drobnoustrojów dała dobre wyniki, szczególnie w zakresie zwiększenia wydajności produktów. U //Acremonium chrysogenum// uzyskano w ten sposób wzrost wydajności produkcji cefalosporyny o 40%. Grzyby stosowane do biosyntezy antybiotyków nie mają w swoim cyklu rozwojowym etapu rozmnażania płciowego. Do ich krzyżowania można wykorzystać cykl paraseksualny. Podczas hodowli grzybni wegetatywnej dwóch haploidalnych szczepów może dochodzić między nimi do plazmogamii, w efekcie powstają komórki heterokariotyczne. Następny etap, równie rzadki polega na zlewaniu się jąder-kariogamii, dzięki czemu powstają komórki diploidalne. Znaczenie biotechnologiczne ma możliwość wystąpienia mitotycznej rekombinacji genetycznej i wytworzenie diploidalnych rekombinantów. Końcowym etapem jest segregacja materiału genetycznego i haploidyzacja, w wyniku czego otrzymuje się haploidalne rekombinanty o zmodyfikowanym zestawie genów. Przeprowadzono doświadczenie podczas którego skrzyżowano protoplasty dwóch szczepów Acremonium chrysogenum produkujących cefalosporynę C. Jeden z nich był wysoko wydajny, ale rosnął wolno i nie wytwarzał spor, natomiast drugi miał właściwości odwrotne. Otrzymano mieszańca, który łączył w sobie cechy szybkiego wzrostu, dobrej sporulacji oraz dużej wydajności produkcji antybiotyku. Wytwarzał cefalosporynę C z wydajnością o 40% większą aniżeli lepszy ze szczepów rodzicielskich. == Bibliografia == "Biotechnologia i chemia antybiotyków" Aleksander Chmiel i Stefan Grudziński, Wydawnictwo naukowe PWN Z książki tej pochodzą rysunki nr. 1, 2, 4, 5, 6, 7 "Biotechnologia podstawy mikrobiologiczne i biochemiczne" Aleksander Chmiel, Wydawnictwo naukowe PWN. Z książki tej pochodzą rysunki nr. 3, 8 http://www.emlab.com/app/fungi/Fungi.po?event=fungi&species=1&type=secondary http://www.mycology.adelaide.edu.au/Fungal_Descriptions/Hyphomycetes_(hyaline)/Acremonium/ http://www.doctorfungus.org/thefungi/Acremonium.htm http://en.wikipedia.org/wiki/Acremonium ====== Produkcja sosu sojowego ====== {{grupa11:1a.jpg|}} **Zdjęcie.2 Różnorodność sosów sojowych.** Sos sojowy jest jedną z najstarszych przypraw świata i został wyprodukowany ponad 2500 lat temu w Chinach. Jest on otrzymywany tradycyjną metodą w wyniku poddania fermentacji mieszanki tłuczonej soi, soli i enzymów - proces ten trwa od 6 miesięcy do 2 lat. Jest on również otrzymywany sztucznie poprzez proces chemiczny przy użyciu specjalnego koncentratu - proces ten trwa 3 dni. Sos sojowy został wykorzystany do wzmocnienia smaku wielu rodzajów żywności. {{grupa11:2a.jpg|}} **Zdjęcie.3 Sosy sojowe.** ===== Surowce ===== ==== Nasiona soi ==== Zostały określone jako "król roślin strączkowych" ze względu na ich cenne właściwości odżywcze. Spośród wszystkich fasoli, nasiona soi zawierają najwięcej wysokowartościowego biologicznie białka roślinnego, o odpowiednim dla człowieka składzie aminokwasowym. Są one również bogate w tłuszcze oraz minerały, zwłaszcza wapń i magnez oraz witaminy z grupy B. Owłosione strąki zawierają dwa lub trzy nasiona, które mogą być małe i okrągłe lub większe i bardziej wydłużone. Ich kolor zmienia się od żółto-brązowego, poprzez zielony do czarnego. Nasiona soi są bardzo ważnym surowcem do produkcji pasz i stanowią również cenny pokarm dla człowieka. Soja jest produktem bezglutenowym o właściwościach antymiażdżycowych, podwyższających odporność organizmu. W sosie sojowym nasiona soi są tłuczone przed ich mieszaniem z innymi składnikami. {{grupa11:3a.jpg|}} **Zdjęcie.4 Nasiona soi.** ==== Pszenica ==== Pszenica jest dodawana do zacieru zgniecionych nasion soi. W wielu recepturach pszenica jest mieszana w równych proporcjach z soją - np. ciemny sos Koikuch, albo w mniejszych - np. bardzo ciemny sos Tamari, lub większych - np. biały sos Shiro. ==== Sól ==== Soli lub chlorku sodu dodaje się na początku fermentacji. Sól jest nie tylko dodawana do smaku, ale również pomaga ustanowić właściwe środowisko chemiczne dla bakterii fermentacji mlekowej i drożdży. Wysokie stężenie soli jest również konieczne, aby pomóc w ochronie gotowego produktu przed zepsuciem. ==== Agenty fermentacji ==== Mieszanka soi i pszenicy poddawana jest działaniu szczepów pleśni o nazwie //Aspergillus oryzae// lub //Aspergillus soyae//, które rozkładają białka w zacierze. Dalsza fermentacja następuje poprzez dodanie bakterii fermentacji mlekowej (//Pediococcus halophilus//) i drożdży. ==== Konserwanty i inne dodatki ==== Benzoesan sodu lub kwas benzoesowy są dodawane w celu powstrzymania rozwoju mikroorganizmów w gotowych sosach sojowych. Metoda chemiczna wymaga dodania dodatkowych agentów koloru i smaku. ===== Proces produkcji ===== ==== Metoda tradycyjna ==== Tradycyjna metoda otrzymywania sosu sojowego, składa się z trzech etapów: Koji, fermentacja i pasteryzacja. === Koji === Jaka jest różnica między Koji a kulturami Koji? Powszechnie przyjmuje się że Koji jest to mieszanina zawierająca soję, pszenicę, wodę oraz kultury Koji czyli wyselekcjonowane szczepy //Aspergillus oryzae// lub //Aspergillus soyae//. W niektórych źródłach można znaleźc informacje że Koji to same szczepy //Aspergillus// niestety nazwa Koji jest często używana naprzemiennie dla obu przypadków a jej znaczenie zależy od kontekstu zdania. Starannie wyselekcjonowane nasiona soi i pszenicy (lub prażony ryż) są kruszone i mieszane razem w warunkach kontrolowanych. Do mieszaniny dodawana jest woda, która jest gotowana z ziarnami do momentu ich ugotowania i zmiękczenia. Dzięki temu białko łatwiej rozkłada się na aminokwasy. Etap ten pełni również funkcję sterylizacji. Zacier jest pozostawiony do ostygnięcia do około 27°C przed dodaniem //Aspergillus//. Po dodaniu grzyba mieszanina jest odstawiona na trzy dni, w celu dojrzewania, w dużych perforowanych kadziach, za pośrednictwem których rozprowadzane jest powietrze, podczas tego procesu następuje fermentacja tlenowa.W Koji zawierte są duże ilości bardzo wydajnych enzymów katalitycznych, m.in. alfa-amylazę [Alfa-amylaza rozbija wiązanie α(1-4)glikozydowe amylozy dając cząsteczki maltozy (disacharydy α-glukozy)], enzymy proteolityczne (rozkładają białka z soi). Inne enzymy które można znaleź w Koji to m.in. ; sulfatazy, nukleazy, fosfatazy, transglikozydazy, acylazy, depolimerazy-rybonukleotydów. === Fermentacja === Koji jest przekazywany do zbiorników fermentacyjnych, gdzie jest mieszany z wodą i solą (24% NaCl) w celu produkcji zacieru o nazwie moromi. Bakterie fermentacji mlekowej (//Pediococcus halophilus//) są odporne na wysokie stężenie soli, dodane do moromi rozpoczynają proces fermentacji beztlenowej w wyniku którego z glukozy powstaje kwas mlekowy. Kwas ten obniża pH moromi do około 5. Takie warunki z kolei są optymalne dla drożdży //Candida// i/lub //Zygosaccharomyces rouxii// które rozpoczynają proces fermentacji alkoholowej. Moromi musi fermentować przez kilka miesięcy, podczas których klej z soi i pszenicy zamienia się w pół-płynny, czerwonawo-brązowy "dojrzały zacier". Ten proces fermentacji tworzy ponad 200 różnych związków smaku i zapachu np. Związki smakowe : peptydy, aminokwasy [m.in. kwas glutaminowy (działa jako wzmacniacz smaku), kwas asparaginowy, lizyna, alanina, glicyna, tryptofan], cukry (głównie glukoza), alkohole (m.in. etanol i alkohol izoamylowy), kwasy organiczne m.in. kwas mlekowy i bursztynowy (działają jako dodatki smakowe, ale także jako konserwanty), estry. Związki zapachowe : częśc aminokwasów i cukrów redukujących przechodzi reakcję Maillarda [http://pl.wikipedia.org/wiki/Reakcja_Maillarda] dając m.in. pirazyny związki o bardzo charakterystycznym zapachu chleba, krakersów orzeszków dodatkowo można wyróżnic takie związki zapachowe jak : ang. 2-phenylethanol, 3-(methylsulfanyl)propanal (methional), tautomery 4-hydroxy-5-ethyl-2-methyl- i 4-hydroxy-2-ethyl-5-methyl-3(2H)-furanone (4-HEMF), 4-hydroxy-2,5-dimethyl-3(2H)-furanone (4-HDF), i 3-hydroxy-4,5-dimethyl-2(5H)-furanone (sotolone). Ponadto 3-methylbutanal (słodowy), 4-HEMF (przypominający karmel), 2-methylbutanal (słodowy), methional (gotowanych ziemniaków), i ethyl 2-methylpropanoate (owocowy). {{grupa11:4a.jpg|}} **Zdjecie.5 Fermentacja.** === Pasteryzacja === Po około sześciu miesiącach (do 2 lat) od fermentacji, surowy sos sojowy jest oddzielany od pozostałości ciasta z pszenicy i soi przez naciśnięcie go szmatką z warstw filtracyjnych. Płyn, który wyłania się jest następnie pasteryzowany. Pasteryzacja procesu pomaga przedłużyć okres ważności produktu gotowego, sos sojowy staje się przejrzysty i zyskuje na aromacie. Wreszcie, jako ciecz sos sojowy jest butelkowany. {{grupa11:5a.jpg|}} **Rys.9 Krótki schemat produkcji sosu sojowego.** ==== Metoda chemiczna ==== W tej metodzie zamiast fermentacji, doprowadza się do sztucznego rozbicia białek sojowych przez proces chemiczny znany jako hydrolizą. Proces ten zachodzi o wiele szybciej niż tradycyjny proces produkcji sosu sojowego. * 1. W tej metodzie, nasiona soi są gotowane w kwasie solnym w wysokiej temperaturze pod ciśnieniem do 15-20 godzin, w celu utworzenia hydrolizowanego białka roślinnego. Następnie mieszanina jest schładzana, aby zatrzymać reakcję hydrolityczną. * 2. Ciecz jest neutralizowana i oczyszczana przez filtrację. * 3. Sól, karmel, chemiczne konserwatory i środki aromatyzujące są dodawane do tej mieszanki w celu uzyskania odpowiedniego koloru i smaku. Mieszanina jest następnie rafinowana i pakowana. Sosy produkowane przez chemiczne metody są ostrzejsze w smaku, jak te produkowane w tradycyjny sposób. Zawierają również domieszkę alkoholu, dodawanego w celu uchronienia produktu przed zepsuciem. W 2001 roku w Wielkiej Brytanii Agencja Standardów Żywności (FSA) testowała różne sosy sojowe produkowane tą metodą. Wykryto w nich wysoki poziom toksycznego 3-MCPD. Metodą tradycyjną wytwarza się obecnie jedynie około 1% sosów sojowych. == Bibligrafia == www.clearspring.co.uk Ze strony tej pochodzą zdjęcia nr. 2, 3, 4, 5 oraz rysunek nr. 9 www.answers.com http://pubs.acs.org/cgi-bin/abstract.cgi/jafcau/2007/55/i15/abs/jf0709092.html http://www.kikkomanusa.com/_pages/manufacturer/basics/characterising_soy.asp?loc=103&subsection=basics&subsection2=characterizing