Członkami rodziny Clostridium są bakterie gramdodatnie, przetrwalnikujące oraz beztlenowe.

Rodzaj ten obejmuje ok 60 gatunków drobnoustrojów, powszechnie występujących przede wszystkim w glebie oraz przewodzie pokarmowym ludzi i zwierząt, narządach rodnych kobiet, a także w wodzie i ściekach. Bakterie te cechują się możliwością wiązania azotu atmosferycznego oraz redukcji siarczanów (IV). Większość bakterii z tego rodzaju to saprofity, przeprowadzające procesy fermentacyjne oraz rozkładające celulozę i pektyny. Pod mikroskopem można je zaobserwować jako laseczki z wybrzuszeniem na terminalnym końcu. Barwienie metodą Grama, jest dobrym sposobem do identyfikacji tych bakterii, ponieważ komórki pobierają barwnik, podczas gdy spory pozostają nie wybarwione. W warunkach optymalnych Clostridium wykazuje najlepszy wzrost na płytce z agarem w temperaturze ludzkiego ciała. Gdy wystąpią czynniki stresowe, bakterie te produkują przetrwalniki tolerujące ekstremalne warunki otoczenia, w których normalne formy nie mogłyby żyć.

Poniżej zostaną omówione podstawowe gatunki z grupy Clostridium.

Rys. 1 C. tetani Źródło:http://www.bact.wisc.edu/themicrobialworld/C.tet.Spores.jpg

Występuje w glebie, głównie mocno nawożonej oraz w przewodach pokarmowych i odchodach różnych zwierząt. U ludzi ilość tej bakterii może się wahać od 0 do 25 % flory bakteryjnej. Występuje ona przejściowo i jej obecność zależy od rodzaju przyjmowanych pokarmów. C. tetani produkuje terminalne spory z wypukłym sporangium nadając im kształt tzw. buławek (patrz rys.1). Tężec jest śmiertelną chorobą ludzi. Śmiertelność waha się od 40 do 78 %. U podłoża tej choroby nie leży sama inwazyjna infekcja patogenu, ale potencjalna neurotoksyna – tak zwana toksyna tężca lub tetanospazmina produkowana podczas wzrostu komórek, sporulacji i lizy. Zakażenie często zajmuje tylko niewielki obszar z małymi „zniszczeniami” spowodowanymi stanem zapalnym. Wędruje ona szlakiem bodźców nerwowych i dociera do centralnego układu nerwowego. Do klinicznych objawów należą m.in. ostre bolesne skurcze mięśni i sztywność mięśni zależnych od woli. Charakterystycznym objawem jest skurcz mięśni żwaczy. Najpierw dochodzi do sztywnienia i postępujących skurczy mięśni kończyn i tułowia. Śmierć następuje najczęściej z powodu zakłócenia mechanizmu oddychania. Połowa zgonów spowodowana przez tę bakterię następuje z powodu tzw. tężca noworodków. Występuje on po infekcji kikutów pępowinowych niemowląt urodzonych przez kobiety nie szczepione przeciwko tężcowi. Dodatkowo zła higiena podczas porodu lub różne praktyki kulturowe mogą przyczynić się do tego typu zachorowań.

Wyodrębniono 11 szczepów C. tetani na podstawie występowania antygenów rzęskowych. Różnią się one zdolnością do produkcji toksyny tężca, ale wszystkie te szczepy produkują toksynę, która ma identyczne właściwości immunologiczne i farmakologiczne. Tetanospazmina jest kodowana przez gen plazmidu występującego we wszystkich szczepach toksynogennych. Jak już wspomniano wcześniej, jest ona uwalniana tylko podczas lizy komórki przy nadmiernym wzroście spor lub wzroście komórek wegetatywnych. Tetanospazmina jest produkowana jako pojedynczy, polipeptydowy łańcuch o masie 150 kDa, który jest następnie cięty zewnątrzkomórkowo przez bakteryjną proteazę do100 kDa ciężkiego łańcuch – fragment B oraz do 50 kDa lekkiego łańcucha – fragment A. Pozostają one związane mostkiem disiarczkowym. Ponieważ w organizmie ludzkim działa ona na układ nerwowy jest ona uważana za neurotoksynę, jednakże nie są znane żadne użyteczne jej zastosowania. W przeciwieństwie do innych chorób wywołanych toksynami, nawet śmiertelna dawka tetanospazminy nie wywołuje reakcji układu odpornościowego. Anatoksyna (chemicznie odzjadliwiona toksyna) jest natomiast wykorzystywana jako środek uodparniający przeciwko tężcowi.

Jest dużą bakterią formującą subterminalne endospory. Występuje głównie w glebie oraz osadach w jeziorach i sadzawkach, jak również rozkładających się roślinach. W związku z tym może ona również występować przejściowo w przewodach pokarmowych ptaków, ssaków i ryb. Bakterie te produkują toksynę nazwaną botuliną, pomimo że różne szczepy wydzielają różne toksyny. Toksyny te przyjęły skróty: A, B, Ca, Cb, D, E, F oraz G. jednakże nie wszystkie bakterie z grupy C. botulinum produkują toksyny, jak również serotyp C i D jest produkowany przez lizogenicznego faga. Typ G tej toksyny jest prawdopodobnie kodowany przez plazmid. Objawy zatrucia botuliną opisuje się jako botulizm. Rozróżniamy dwie główne formy botulizmu: zatrucie pokarmowe oraz botulizm niemowląt. Botulizm pokarmowy wywołany jest przez spożycie jedzenia zanieczyszczonego kiełkującymi sporami, które wydzielają botulinę. Jest ona absorbowana w jelicie cienkim i w dwunastnicy, następnie dostaje się do krążenia i dociera do nerwowo – mięśniowych synaps. Tam łączy się z receptorami na presynaptycznej błonie i blokuje uwalnianie neurotransmitera – acetylocholiny, która jest konieczna do pobudzenia mięśni. Botulizm pokarmowy nie jest infekcją, ale zatruciem spowodowanym botuliną. Najczęściej zatruć można się po zjedzeniu jarzyn konserwowanych domowymi sposobami w zasadowym pH lub zanieczyszczonego, nie ugotowanego pokarmu. Spory C. botulinum są stosunkowo odporne na wysokie temperatury i mogą przetrwać proces sterylizacji podczas niewłaściwej konserwacji. Do objawów zatrucia pokarmowego występująch zwykle 12 – 36 godz. po spożyciu toksyny należą: podwójne widzenie, zaburzenia połykania, niedrożność porażenna jelit, zatrzymanie moczu, znużenie, a ostatecznie porażenie oddychania. W ciężkim przypadku botulizm pokarmowy objawia się jako groźna dla życia, porażenna choroba. Porażenie jest zstępujące i najpierw obejmuje nerwy czaszkowe. Później proces postępuje dośrodkowo, zwykle symetrycznie. Botulina może również działać taką samą drogą jak toksyna tężca i działać na centralny układ nerwowy, ale takie działanie występuje bardzo rzadko. Botulizm niemowląt jest obecnie najczęstsza postacią botulizmu, szczególnie u dzieci między 3 a 20 tygodniem życia. Prawdopodobnie jest on spowodowany przez karmienie miodem zawierającym spory C. botulinum. Wprawdzie toksyny nie można wykryć we krwi, podejrzewa się jednak, że objawy są spowodowane przez uwalnianie toksyny do światła jelit przez rozmnażające się bakterie. To, że nie można jej wykryć jest spowodowane najprawdopodobniej współdziałaniem kilku czynników takich jak: niski poziom syntezy lub słabe wchłanianie jelitowe i szybkie usuwanie z układu krążenia, dzięki wysokiemu powinowactwu do płytek nerwowo – mięśniowych. Zakażone dziecko jest bardzo osłabione i ma objawy porażenia wiotkiego. Występują zaburzenia przewodnictwa nerwowego charakterystyczne dla botulizmu.

Rys. 2 Struktura botuliny. Źródło: http://www.bact.wisc.edu/themicrobialworld/botox1.jpg

Botulina jest syntetyzowana jako pojedynczy polipeptydowy łańcuch o masie ok. 150 kDa. W tej formie ma ona niską toksyczność, dlatego jest cięta przez bakteryjną proteazę do dwóch łańcuchów: lekkiego (A) o masie 50 kDa oraz ciężkiego (B) o masie 100 kDa. Te dwa łańcuchy połączone są mostkiem disiarczkowym. Toksyny od A do F to neurotoksyny, które zaburzają neuroprzekaźnictwo w obwodowych synapsach cholinergicznych przez zahamowanie uwalniania acetylocholiny, powodując porażenie wiotkie. Toksyna G jest jedyną toksyną, która nie jest związana z objawami chorobowymi. Botulina nie powoduje odpowiedzi układu immunologicznego ponieważ dawka potrzebna do jego aktywacji jest już śmiertelna.

W minimalnych dawkach, botulina jest używana w dermatologii oraz w leczeniu bolesnych skurczy mięśni. Komercyjnie dostępna jest pod nazwą Botox. Wykorzystywane są tu głównie typ A oraz typ B tej toksyny. Podanie małych dawek miejscowo do konkretnych mięśni twarzowych powoduje zablokowanie impulsów mięśniowych. Osłabia to czasowo te mięśnie i wygładza niechciane zmarszczki. Botulina A jest przeznaczona głównie do wygładzania zmarszczek między brwiami. Botox’u używać można do skorygowania tzw. kurzych łapek w kącikach oczu, zmarszczek na czole oraz szyi.

Rys. 3 Przed i po zastosowaniu botoxu. Źródło: http://www.aad.org/public/publications/pamphlets/_img/Before.jpg i http://www.aad.org/public/publications/pamphlets/_img/After.jpg

Jak można zauważyć efekty są dobrze widoczne. Nie można jednak zapomnieć o skutkach ubocznych, które wprawdzie są przejściowe i nie występują u wszystkich, ale mogą dawać duży dyskomfort. Należą tu przede wszystkim: mocne bóle głowy, opadające powieki czy krwiaki w miejscu iniekcji. Dodatkową wadą jest konieczność ponownej aplikacji po ok. 6 miesiącach oraz wysoka cena zabiegu.

Jest ruchliwą bakterią szeroko rozpowszechnioną w naturze, głównie w glebie. Może też być częścią normalnej flory bakteryjnej jelit u ok. 50 % dzieci poniżej dwóch lat. Sporadycznie występuje u ludzi powyżej tego wieku. Jest ona odporna na wiele antybiotyków. Jest przenoszona między ludźmi drogą feralno – oralną. Może ona powodować biegunkę związaną ze stosowaniem antybiotyków oraz rzekomobłoniaste zapalenie jelit. Do stanu takiego może prowadzić zbyt duży wzrost tych bakterii w jelicie grubym zakłóceniu mikroflory panującej w układzie pokarmowym lub zakażenie od innych osób przy barku odpowiedniej higieny, np. w szpitalach. C. difficile produkuje cytotoksyny, z których najlepiej poznane są: cytotoksyny A i B. Cytotoksyna A jest opisywana jako enterotoksyna ponieważ powoduje zatrzymywanie płynów w jelitach. Cytotoksyna B wywiera natomiast wysoce śmiertelne działanie. Biegunka wywołana C. difficile związana ze stosowaniem antybiotyków występuje najczęściej podczas stosowania antybiotyków o szerokim spektrum działania. W większości przypadków mija ona po zaprzestaniu stosowania antybiotyku. Może ona jednak ułatwić niekontrolowany wzrost bakterii odpornych na antybiotyki, głównie C. difficile. Do objawów należ tu głównie: obfita, wodnista i często krwawa biegunka, leukocyty w stolcu i leukocytoza (ok. 50% pacjentów) oraz temperatura powyżej 39°C. W ciężkich przypadkach może dojść do rozwinięcia się rzekomobłoniastego (martwiczego) zapalenia jelit jako następstwa po uwalnianiu cytotoksyn przez nieinwazyjne szczepy C. difficile. Jest to groźne dla życia powikłanie. Objawem tego jest wysięk zawierający włóknik, mucynę oraz wielojądrzaste leukocyty przylegające do śluzówki, który przypomina błony.

Rys. 4 Rzekomobłoniaste zapalenie jelit. Źródło: http://www.cfpc.ca/cfp/2004/Nov/vol50-nov-cme-1.asp?stype=advanced&

Na rysunku 4. można zaobserwować zaznaczone czarnymi strzałkami opisane wyżej pseudobłony.

Jest to bakteria nieruchliwa. Jest ona szeroko rozpowszechniona w naturze. Może występować w rozkładających się warzywach, osadach morskich, przewodzie pokarmowym ludzi i innych kręgowców, w owadach i glebie. Bakterie te wytwarzają 12 egzotoksyn i enterotoksynę. Ze względu na produkowane toksyny wyróżniono 5 typów bakterii C. perfringens od A do E. Wywołują one zatrucia pokarmowe lub różne zakażenia skóry lub tkanki podskórnej.

Egzotoksyny: α – toksyna, β – toksyna, ε – toksyna, κ – toksyna oraz ι – toksyna. α – toksyna (lecytynaza) jest główną toksyną. Występuje u wszystkich typów C. perfringens, ale w największej ilości jest produkowana przez typ A. Ma ona bardzo silne właściwości nekrotyzujące i hemolityczne - rozkłada cenne białko transportowe lecytynę oraz białka krwi. Powoduje one między innymi uszkodzenia fosfolipidów błon, osłonek nerwowych i leukocytów. Hydrolizuje również sfingomielinę. In vivo powoduje ona uszkodzenie fosfolipidów błony komórkowej i mitochondrialnej. Wszystkie te toksyny zaaplikowane zwierzętom laboratoryjnym powodują ich śmierć. κ – toksyna (kolagenaza) odpowiada za niszczenie tkanek w czasie trwania zgorzeli gazowej. Enterotoksyna jest wytwarzana podczas sporulacji. Hamuje transport glukozy, powoduje utratę białek i uszkodzenie nabłonka jelitowego. Do zatrucia pokarmowego Clostridium perfringens typu A dochodzi najczęściej w wyniku spożycia skażonych zarodnikami potraw: konserw mięsnych i warzywnych, miodów, sosów, zup, szynek pasteryzowanych, drobiu, przetworów z roślin strączkowych. Innym – występującym ostatnio coraz częściej – źródłem Clostridium perfringens jest woda, głównie ścieki. Często dotyczy to wody, która zanieczyszczona ściekami, może zostać pobrana w wodociągach lub studniach. Czynnikiem determinującym toksyczność C. perfringens typu A jest wytwarzana przez bakterie w jelicie enterotoksyna. Jak wcześniej wspominano, do zatrucia dochodzi w wyniku spożycia żywności skażonej sporami, które są niestety bardzo oporne na temperaturę. Nawet długie gotowanie niewiele pomaga. Do uwolnienia samej enterotoksyny dochodzi w czasie rozwijania się spor w dojrzałe komórki bakteryjne w jelicie cienkim i grubym. Do objawów należą głównie gwałtowne i bardzo silne bóle brzucha z niewielką biegunką, często z domieszką krwi.

Niewątpliwie najgroźniejsza jest zgorzel gazowa, występująca w skażonych, głębokich ranach. Od zakażenia rany laseczkami zgorzeli gazowej do wystąpienia pierwszych objawów, jakimi są silny ból i obrzęk rany, mija od kilku do kilkudziesięciu godzin. Natężenie miejscowego bólu i dalszych objawów zależy od tego czy zakażeniu uległa tylko skóra i tkanka podskórna czy też również tkanka mięśniowa. Z rany zaczyna sączyć się wydzielina o barwie od przezroczystej do krwistobrunatnej. Dołącza się również silny i twardy obrzęk tkanki otaczającej ranę, będący wynikiem wyniszczającego działania toksyny kappa (kolagenazy). W tkance otaczającej ranę dochodzi ponadto do zakrzepów drobnych naczyń krwionośnych. Przy uciskaniu zakażonej rany wyczuwa się trzeszczenie banieczek gazu wytwarzanego przez laseczki C. perfringens. Po kilku godzinach od wystąpienia pierwszych objawów obserwuje się bardzo często znaczną gorączkę, wymioty, bóle brzucha, krwistą biegunkę, wymioty. Leczenie zgorzeli gazowej polega na chirurgicznym opracowaniu rany, podawaniu antybiotyków z grupy penicyliny i leczeniu tlenem hiperbarycznym (hamuje wzrost i uwalnianie toksyn przez bezwzględne beztlenowe laseczki). Innym schorzeniem wywołanym przez C. perfringens jest miejscowe zapalenie tkanki podskórnej, spotykane często u chorych na cukrzycę, np. po amputacji kończyny. Zakażenie ropne i ropienie wywoływane przez C. perfringens spotyka się w pęcherzyku żółciowym, macicy, jajowodach i jamie brzusznej.

Rys. 5 Rana czysta i rana zakażona C. perfringens. Źródło: http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/ency/imagepages/17190.htm

β – toksyna typu C wywoływać może martwicze zapalenie jelita cienkiego, polegające na odsłonięciu ściany jelita przez proces owrzodzeniowy. Laseczka C. perfringens jest także przyczyną licznych zakażeń szpitalnych, będących wynikiem zanieczyszczenia rany lub tkanek w czasie operacji przez kał lub wydzieliny dróg rodnych (w których laseczki C. perfringens występują jako naturalna flora). W takiej sytuacji powinno być natychmiast wdrażane leczenie antybiotykami β-laktamowymi w połączeniu z innymi antybiotykami o szerokim spektrum działania.

Clostridium butyricum jest typową bakterią kwasu masłowego występującą w glebie i przewodzie pokarmowym ludzi oraz zwierząt. Przeprowadzają one fermentację cukrów np. glukozy w lotny kwas masłowy i produkty gazowe. Kwas masłowy znajduje zastosowanie w przemyśle spożywczym, np. mleczarskim, czy do produkcji estrów. Hodowle bakterii w bioreaktorach są prowadzone w sposób ciągły lub okresowy. Największą wydajność produkcji otrzymać można w pH 6,5. Bakterie te w przyrodzie i przemyśle czasami też są szkodnikami. Powodują tzw. późne wzdęcia serów podpuszczkowych dojrzewających, psucie się konserw warzywnych i owocowych oraz kiszonych pasz. Fermentacja masłowa przebiega zgodnie z równaniem:

                              glukoza → kwas masłowy + 2CO2 + 2H2 + wolna energia

Oprócz kwasu masłowego powstają również liczne produkty uboczne, np. kwas octowy, alkohol metylowy, metan, aceton, alkohol butylowy. Przebieg fermentacji zależy od gatunku bakterii i odczynu środowiska. W środowisku obojętnym głównym produktem jest kwas masłowy, a w środowisku kwaśnym te same bakterie wywołują fermentacje acetobutanolową.

Clostridium butylicum jest bakterią anaerobową. Jak podają niektóre źródła, bakteria ta jest tak na prawdę synonimem innej bakterii z grupy Clostridium, a mianowicie C. beijerinckii. Przeprowadza ona fermentację cukrów prostych. Jest obecnie wykorzystywana w przemyśle do produkcji rozpuszczalników takich jak: aceton, izopropanol i n – butanol. Jest to bardzo ważne, ponieważ ekonomiczne względy skłaniają ludzi do poszukiwania innych dróg niż syntetyczne do otrzymania tego rodzaju związków chemicznych. Różne szczepy produkują te chemikalia z różną wydajnością, lub któregoś nie produkują wcale. Aby zwiększyć wydajność produkcji można użyć kokultury C. butylicum i C. pasteurianum. Przeważnie stosunek powstających w trakcie fermentacji rozpuszczalników wynosi: 6:3:1 dla: butanol: aceton: etanol. Jest to proces seryjny i gdy produkt jest gotowy zostaje oddzielony od biomasy. Proces przebiega w dwóch etapach. Najpierw bakterie działają bakterie wytwarzające kwas masłowy, w tym przypadku jest to C. pasteurianum, a następnie bakterie które przekształcają kwas masłowy w butanol czyli C. butylicum. W trakcie procesu technologicznego, kokultura bakteryjna jest mieszana z glukozą i umieszczana w bioreaktorze w odpowiedniej pożywce. Fermentacja jest prowadzono do momentu zakończenia produkcji gazu. Największą aktywność wykazują w temperaturze 37 °C. Dzięki tym ulepszeniom wydajność procesu w porównaniu do tradycyjnych metod wzrasta o ok. 20%, a zawartość butanolu w mieszaninie rozpuszczalników wynosi ok. 70 % masy.

Jest to mezofilowa, niepatogenna bakteria. Forma wegetatywna wymaga do życia warunków anaerobowych. W środowisku tlenowym wytrzymuje do kilkunastu godzin i tworzy spory, które mogą przetrwać lata w niekorzystnych warunkach. Cechuje ją peritrichalne urzęsienie. Bakteria ta wyizolowana i opisana została mniej więcej w latach 1912-1914 roku przez Chaima Weizmanna, który w 1916 roku był jednym z naukowców, którzy opracowali technikę masowej produkcji acetonu, butanolu i etanolu (tzw. A.B.E. Process) przez C. acetobutylicum ze skrobii i melasy, co podczas I Wojny Światowej posłużyło do wytwarzania prochu czy TNT. Technika A.B.E. w oryginalnej postaci była szeroko rozpowszechniona do lat 40stych XX wieku, kiedy to znaczny wzrost cen cukru (spowodowany ograniczeniem taniego importu z Kuby) spowodował, że wprowadzono bardziej wydajną technologię opartą na wykorzystaniu tego źródła. Najlepiej poznanym szczepem jest szczep ATCC 824, obecnie zsekwencjonowany, wyizolowany w Connecticut z ziemi w 1924 r. Szczep ten jest blisko spokrewniony ze szczepem Weizmanna.

Pierwotnie produkcję prowadzono w sposób okresowy. Jako pożywkę stosowano odpady kukurydziane czy melasę jako roztwory wodne z doprowadzanym dopływem dwutlenku węgla, które umieszczano w bioreaktorze i inokulowano kulturami, które normalnie były przechowywane w postaci spor w sterylnym piasku czy ziemii. Sporulację wywoływano przetrzymywaniem ich w temperaturze 65-100°C przez 1-3 min i po paru takich zabiegach dodawano je do fermentora. Proces wykorzystujący kukurydzę jako pożywkę dla bakterii przeprowadzano w temperaturze 34-39°C przez 40-60 h i otrzymywano wydajność 24-26% suchej masy użytych ziaren (6:3:1 - butanol:aceton:etanol). Fermentacja bazująca na melasie prowadzona była w temp 29-35°C i z nieco większa wydajnością. Rozdział produktów następował przez destylację i frakcjonowanie. Otrzymywano czysty aceton i butanol w stężeniu ok. 4% (w/v). Odpady stałe, jako cechujące się wysoką zawartością białka i witamin z grupy B wykorzystywane były do produkcji pasz dla zwierząt. Właściwości produkcyjne C. acetobutylicum są na tyle interesujące, że bakterie tę można wykorzystać do otrzymywania biopaliwa z butanolu i stąd rosnące zainteresowanie. Butanol ma przewagę nad etanolem jako biopaliwo chociażby dlatego, że w przeciwieństwie do etanolu można go transportować rurociągami, jest mniej lotny, higroskopijny i wydajniejszy a także nie powoduje korozji.

Obecnie technologia produkcyjna jest opatentowana przez Environmental Energy Inc. i Ohio State University i w jej wyniku jako produkt otrzymuje się butanol jako główny produkt i ograniczenie innych produktów ubocznych. Odbywa się to tak, że w pierwszym etapie wykorzystuje się C. tyrobutylicum do produkcji kwasu masłowego, który jest następnie przekształcany właśnie przez C. a. do butanolu. Clostridia jako źródło energii i węgla mogą wykorzystywać nie tylko skrobię ale również zboża, cukier, ligninę czy celulozę. Produktami ubocznymi są dwutlenek węgla, wodór, gliceryna, eter, kwas propionowy. System produkcji jest bardzo prosty, a rozdział produktów ze względu na ich układanie się w warstwy jest również łatwy. Dodatkowo fakt, iż w wyniku takiej fermentacji powstaje również wodór, jest to interesujący obiekt do badań nad innymi alternatywnymi źródłami energii. Nie tylko C. acetobutylicum może być wykorzystywany do produkcji butanolu. Inne gatunki produkują podobne substancje, lecz w innych proporcjach; np. C. butylicum zamiast acetonu produkuje izopropanol a C. aurantibutylicum i aceton i izopropanol (oczywiście butanol także).

Rys. 6 C. acetobutylicum Źródło: http://blogs.princeton.edu/chm333/f2006/biomass/bioethanol/06_major_issue_biobutanol/

Ciekawe jest to, iż używając kokultur możemy prowadzić nawet fermentację bazującą na surowcach celulozowych i hemicelulozowych, np. C. cellulolyticum lub C. thermocellum (produkujące cellulazy i ksylanazy) wraz z C. acetobutylicum. Uzyskuje się głownie kwas masłowy z domieszką kwasu octowego, etanolu i butanolu. Inną właściwością niektórych Clostridia (w tym C. acetobutylicum) jest zdolność do wiązania azotu atmosferycznego. Redukują one azot do związków amonu i w takiej postaci jest od wbudowywany w struktury bakteryjne. Dowiedziono to dzięki badaniom z użyciem izotopu 15N. Izolacja tych bakterii ze środowiska jest prosta mając na uwadze fakt, iż są to organizmy sporulujące a ich warunki wzrostu nie są wymagające. Są więc wszechobecne. Bakterie te można spotkać w środowisku bytujące na żywych roślinach, bądź też gnijących jednak rzadziej. Rewelacyjnym materiałem do izolacji są korzenie roślin motylkowych lub innych czy np. bulwy ziemniaka. Izolowano również je z rosnących zbóż, owoców (agrestu) i ziemii uprawnej. Szczepy dzikie, które były prekursorami tych obecnie używanych w fermentacjach selekcjonowano pod względem wydajności produkcji, oporności na bakteriofagi, zapotrzebowaniu na składniki odżywcze i oczywiście zostały poddane modyfikacjom genetycznym.

Vijoen, Fred i Peterson pierwsi opisali ją po izolacji w 1926 roku z końskiego żołądka, jakkolwiek uzyskanie czystej kultury zajęło im 25 lat (ciężko je odizolować od termofilnych glikolitycznych szczepów). Clostridium thermocellum jest gram-pozytywną, przetrwalnikującą anaerobową termofilną bakterią. Nie jest patogenna. Nie wykazuje zdolności ruchu. Optimum wzrostu przypada na 60-60 °C i pH 6,1 – 7,5. Bardzo wolno rośnie. Czas generacji uzyskiwany na celulozie to 7 godzin. Jest w kręgu zainteresowań ze względu na swoje właściwości cellulolityczne; potrafi dokonać bezpośredniej konwersji celulozy do etanolu i jest przy tym najlepiej scharakteryzowana. Oprócz tego rozkłada oligomery celobiozy, ksyloz i monosacharydy takie jak glukoza, fruktoza czy ksyloza ale po dłuższej adaptacji do takiego źródła węgla. Dla niektórych szczepów preferencyjnym źródłem węgla jest nie, jakby się mogło wydawać glukoza lecz celobioza. Glukoza gromadzi się wówczas w środowisku jako produkt pośredni rozkładu celobiozy. Dochodzi do tego na drodze hydrolizy celobiozy z użyciem celobioz lub na skutek działalności fosforylazy celobiozy, która rozkłada ją na glukozę i glukozo-1-fosforan. Ta pierwsza również nie jest metabolizowana jak podczas hydrolizy natomiast glukozo-1-fosforan wchodzi w szlak Embdena-Meyerhoffa. Bakteria prowadzi degradację celulozy za pomoca tzw. cellulosomów – zewnątrzkomórkowych kompleksów enzymatycznych zawierających celulazy, endo- i egzoglukanazy . Ich wyjątkową cechą, w przeciwieństwie do cellulaz grzybowych, jest ich wysoka efektywnośc rozkładu celulozy krystalicznej. Cellulosom składa się z około 20 podjednostek katalitycznych i kodowany jest przez około 100 genów, kodujących także m. in. sekwencje represorów, aktywatorów,etc. Aby ułatwić sobie cellulolizę bakteria wytwarza coś w rodzaju pilli z haczykami, aby móc przyczepić się do powierzchni rośliny. Co więcej zbyt wysoka zawartość glukozy w podłoży powoduje odczepianie się bakterii od podłoża. Sytuacja taka ma miejsce w bioreaktorach, natomiast w środowisku naturalnym glukoza taka jest konsumowana przez inne organizmy.

C. thermocellum (źródło: „Cellulose Degradation by Clostridium thermocellum” http://www.biomatnet.org/secure/Air/F201.htm)

Produktami fermentacji obok etanolu (która ma jednak stosunkowo małą wydajność) są glukoza, celobioza, również octan, mrówczan, mleczan, dwutlenek węgla i wodór. Produkcja tego ostatniego być może kiedyś stanie się właściwością C. thermocellum, która posłuży do wykorzystania tej bakterii do produkcji tego rodzaju ekologicznego źródła energii. Maksymalne stężęnie etanolu podczas produkcji, jakie można uzyskać to tylko ok. 0,05% w/w. Sprytnym zabiegiem, który można zastosować jest wprowadzenie przy fermentacji drugiego gatunku termofilnego produkującego etanol, który wykorzysta z pożywki glukozę produkowaną przez C. thermocellum. W ten sposób końcowy efekt może być wzmocniony nawet tysiąckrotnie.

Uproszczony schemat ścieżek metabolicznych C. thermocellum.

Źródło: http://smartech.gatech.edu/bitstream/1853/10027/3/ulbrik_teresa_y_199105_ms_346239.pdf

Inną właściwością niektórych Clostridia (w tym C. thermocellum) jest zdolność do wiązania azotu atmosferycznego. Redukują one azot do związków amonu i w takiej postaci jest od wbudowywany w struktury bakteryjne. Dowiedziono to dzięki badaniom z użyciem izotopu 15N. Niska wydajność produkcji związana jest z efektem sprzężenia zwrotnego podczas fermentacji. Niekorzystne efekty obserwuje się przy wzroście bakterii w środowisku o stężeniu etanolu przekraczającym tylko 1%. Obecnie uważa się, że etanol wpływa na białka transportowe błony komórkowej odpowiedzialne za transport sacharydów do wnętrza komórki. Zaburzony transport odbija się negatywnie na procesach fermentacji i w rezultacie spowalnia wytwarzanie białek zaangażowanych w działanie cellulosomu. Ze względu na swoje właściwości można ją wyizolować z żołądka roślinożercy jak koń czy krowa oraz z każdego środowiska, gdzie znajduje się degradujący materiał roślinny. Zanotowano takie źródła izolatów jak: gleba, bale z bawełny, rozkładające się odpadki, osady rzeczne czy gorące źródła.

C. thermosulfurogenes produkuje pozakomórkową niezwykle termostabilną β-amylazę, natomiast C. thermohydrosulfuricum pullulanazy (rozkładające sieciujące wiązania α(1-6), co jest bardzo pomocne) i glukoamylazy (α(1-4)). Między innymi to właśnie te enzymy amylolityczne wykorzystywane są powszechnie do przemysłowej produkcji glukozy, maltozy itp. ze skrobii (syropy cukrowe), co znajduje zastosowanie w cukiernictwie, piekarnictwie czy produkcji soków. Enzymy bakterii termofilnych oprócz swojej termostabilności (działają w temperaturze ok. 80°C) jako zaletę posiadają również wysoką wydajność w porównaniu do tych występujących u mezofilów. Efektem działalności amylolitycznej jest końcowo produkcja etanolu, która zastosowanie swoje znalazła na skalę przemysłową. Stosuje się kolultury tych dwóch gatunków, najchętniej szczepy mutantowe pod względem represji katabolicznej (działanie β-amylazy) oraz produkujące więcej enzymów niż szczepy dzikie. Bakterie hoduje się w beztlenowych warunkach, zapewniając źródło węgla, witaminy, minerały, czynniki wzrostowe i uzyskuje się oprócz etanolu jako produktu końcowego enzymy, które izoluje się i w formie immobilizowanej wykorzystuje do prowadzenia charakterystycznych dla siebie reakcji.

Clostridium novyi jest patogenem anaerobowym o stosunkowo niewielkim genomie jak na Clostridium. Cieszy się złą reputacją ze względu na umiejętność wytwarzania toksyn o działaniu letalnym w momencie, gdy znajdzie się w środowisku beztlenowym. Przy tym jest powszechnie spotykany we środowisku: szczególnie w glebie i nawozie oraz szeroko rozumianym materiale roślinnym. Po raz pierwszy został jednak wyizolowany z materiału klinicznego gdzie odpowiadał za infekcje u narkomanów wstrzykujących sobie heroinę. Wprowadzony podskórnie lub domięśniowo powoduje nekrozę tkanek, obrzęk złośliwy, nekrotyczne zapalenie powięzi i w niektórych przypadkach śmierć.

Bakterie C. novyi (zielone) niszczące komórki raka jelita grubego (czerwone).

Źródło: “Taking a bite out of tumours” Kristine Novak Nature Reviews Cancer 2, 6 (2002)

Znaczenie tej bakterii wzrosło, od kiedy okazało się, że można wykorzystać ją w walce z rakiem. Badania na zwierzętach wykazały, że bakteria ta rozwija się selektywnie w miejscach o ograniczonym dostępie tlenu (w guzie) niszcząc go przy tym (mechanizm nie jest do końca poznany) i nie powodując szkód organizmowi nosiciela. Warunkiem takiego wykorzystania C. novyi było jednak pozbawienie go właściwości patogennych. Tak stworzony został atenuowany szczep C. novyi-NT, którego dzięki zastosowaniu metod inżynierii genetycznej pozbawiono genów odpowiedzialnych za produkcję toksyn. Dodatkowo stosuje się terapię mieszaną, gdzie wprowadza się oprócz spor bakterii chemoterapeutyki takie jak winkrystyna, winblastyna czy kolchicyna zamknięte w liposomach, które uwalnianę są z nich tylko dzięki specyficznym enzymom produkowanym przez genetycznie zmodyfikowane bakterie. Dzięki bardziej specyficznemu docieraniu leków do guzów umożliwia to stosowanie ich większych dawek. Obecnie metoda ta jest objęta patentem przez John Hopkins University i wykorzystuje spory C. novyi oraz C. sordellii podawany dożylnie lub bezpośrednio do guza.

1. http://butanol.com/docs/AB%20Revisited.pdf “Acetone – Butanol Fermentation Revesited” D. T. Jones, D. R. Woods
2. http://smartech.gatech.edu/bitstream/1853/10027/3/ulbrik_teresa_y_199105_ms_346239.pdf “Cellulolytic fermentation by C. thermocellum” Theresa Yolanda Lustosa Ulbrik”
3. http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/MicrobeWiki
4. http://en.wikipedia.org/wiki/
5. http://www.textbookofbacteriology.net/clostridia.html
6. http://medic.uth.tmc.edu/path/00001496.htm
7. http://www.aad.org/public/publications/pamphlets/cosmetic_botulinum.html
8. http://www.cfpc.ca/cfp/2004/Nov/vol50-nov-cme-1.asp?stype=advanced&
9. http://www.gronkowiec.pl/clostridium_perfringens.html
10. http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/ency/imagepages/17190.htm
11. http://www.freepatentsonline.com/4539293.html
12. http://aem.asm.org/cgi/reprint/45/3/1160.pdf
13. http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/dydaktyka/materialy/MZ_dzienne/iwona/cwiczenie%203.pdf
14. http://www.nauka.rk.edu.pl/w/p/mikrobiologia-zywnosci/
15. http://www.drugresearcher.com/news/ng.asp?id=72652 “GM bacteria eats cancer” Matt Wilkinson
16. Mikrobiologia i choroby zakaźne, Gabriel Virella, Wydawnictwo Medyczne Urban & Partner, Wrocław 2000
17. Batch and fed-batch production of butyric acid by Clostridium butyricum ZJUCB HE Guo-qing (何国庆)†, KONG Qing (孔 青)†‡, CHEN Qi-he (陈启和), RUAN Hui (阮 晖)

Organizmy zdolne do produkcji metanu zostały odnalezione jedynie wśród Archae. Na podstawie porównania sekwencji 16S rRNA oraz różnic fenotypowych wyróżniono następujące rodzaje metanogennych Archaenów:

• Methanobacteriales
• Methanococcales
• Methanomicrobiales
• Methanosarcinales
• Methanopyrales

Methanosarcina, Źródło: http://www.rps.psu.edu/indepth/graphics/ferry.jpg

Wśród metanogenów możemy znaleźć zarówno podrodzaje mezofilne (optymalna temperatura 30-40 ºC), termofilne (Methanothermobacter) jak i hipertermofilne (Methanopyrus, Methanothermus). Niektóre rodzaje są halofilne – Methanohalophilus. Ściany komórkowe metanogenów są bardzo zróżnicowane: mogą być zbudowane z pseudopeptydoglikanu (Methanobacterium), z metanochondroityny (Methanosarcina), białek ( Methanocaldococcus), glikoprotein ( Methanoplanus) lub warsty S ( Methanospirillum).

Wszędzie tam, gdzie nie ma tlenu (metanogeny sa bowiem obligatoryjnymi beztlenowcami) a jest pod dostatkiem substratów dla ich metabolizmu:

1. beztlenowe sedymenty np. jeziorne osady denne, bagna, mokradła, pola ryżowe, wysypiska śmieci
2. układy pokarmowe zwierząt (zawierają głównie Archae metanogenne zdolne do konsumpcji octanu):
   • żwacz przeżuwaczy (np. bydła, owiec, wielbłądów)
   • w wyrostku robaczkowym królików i koni,
   • w jelicie grubym człowieka,
   • w jelicie termitów.
3. kominy hydrotermalne,
4. oczyszczalnie ścieków i urządzenia do przeprowadzania biodegradacji i fermentacji beztlenowej.

Metanogeny są obligatoryjnymi beztlenowcami – w obecności tlenu nie funkcjonują prawidłowo (ich wzrost spowalnia stężenie tlenu 0,01 mg/m3). Ich czas generacji wynosi 15-85 godzin,

Wyróżniamy trzy rodzaje substratów do produkcji metanu:

1. substraty typu dwutlenku węgla: tlenek i dwutlenek węgla oraz mrówczan,
2. substraty metylowe: metanol, metyloamina, di-, trimetyloamina, metylomerkaptan, dimetylosiarczek,
3. octan (dla metanogenów z rodzajów Methanosarcina i Methanosaeta) i pirogronian ( Methanococcus).

Substratami dla większości gatunków należących do rodzajów Methanobacteriales, Methanococcales oraz Methanomicrobiales są wodór i dwutlenek węgla lub mrówczan. Archaeny z rodzaju Methanosarcinales produkują metan głównie z substratów metylowych i kwasu octowego. Mimo, że Archae zdolne do przetwarzania octanu stanowią mniejszość ok. 70% metanu powstaje z tego kwasu.

Drogi syntezy metanu. Źródło: Galagan JE et al. Genome Res. 2002 Apr;12(4):532-42

Istnieją trzy drogi syntezy metanu – w zależności od rodzaju substratu, jednak najbardziej korzystną energetycznie jest ścieżka przez wodór. Koenzymy wymagane do produkcji metanu: metanopteryna, metanofuran, koenzym M, koenzymy F420 i F430 oraz koenzym B.

Biogaz – doskonałe źródło energii odnawialnej - jest produktem beztlenowej fermentacji związków organicznych, zawiera dużą ilość metanu, który powstaje przy udziale metanogennych Archae. W Chinach i Indiach biogaz jest produkowany na potrzeby domowe w małych instalacjach. W Polsce biogaz znany jest także pod nazwą gaz wysypiskowy. Biogaz może być wykorzystywany do produkcji energii elektrycznej i cieplnej, produkcji ogniw paliwowych czy zasilania sieci gazu ziemnego. W 1999 roku w Polsce znajdowało się 29 biogazowni komunalnych, w których fermentowano osady ściekowe, 16 instalacji na gaz składowiskowy – przy składowiskach odpadów oraz jedna biogazownia rolnicza.

• Ciepło spalania biogazu: 22-27 MJ/m3
• Wartość opałowa biogazu: 20-24 MJ/m3

metan (50-75%), dwutlenek węgla (25-45%) a także azot, wodór, tlen, siarkowodór, para wodna, siloksany.

odpady zielone, odpady produkcyjne ( przemysłu spożywczego - np. ścieki cukrownicze) obornik, gnojowica, ścieki, odpady komunalne oraz tzw. rośliny energetyczne

1. hydroliza – przeprowadzana głównie przez bakterie fakultatywnie beztlenowe rozkład białek, wielocukrów, tłuszczy do związków prostych
2. acidogeneza - przekształcanie produktów pierwszego etapu do prostych kwasów organicznych, alkoholi, aldehydów, ditlenku węgla i wodoru za pomocą enzymów fakultatywnych bakterii acidogennych.
3. octanogeneza - przekształcanie powstałych kwasów organicznych do kwasu octowego ( Syntrrophomonas sp., Syntrophobacter sp.); bakterie fakultatywnie beztlenowe zużywają jednocześnie tlen obecny w bioreaktorze, co pozwala na utworzenie się korzystnych warunków rozwoju dla metanogenów.
4. metanogeneza – przekształcenie produktów poprzednich etapów do metanu - zachodzi przy udziale metanogennych Archae zdolnych do przekształcenia kwasu octowego, ditlenku węgla i wodoru do metanu.

W fazach 1 i 2, zwanych fermentacją kwaśną, dominują bakterie: Bacillus, Pseudomonas, Clostridium, Bifidobacterium, Streptococcus, Enterobacterium.

Ze względu na zawartość wszystkich potrzebnych rodzajów mikroorganizmów, jako inokulat najczęściej stosuje się gnojowicę bydlęcą.

1. pH – metanogeny preferują obojętny odczyn środowiska, produkcja metanu jest wydajna dla pH zakresu od 6,6 do 7,6. Wzrost metanogenów jest zahamowany w środowisku o pH < 6,6 a przy pH zasadowym dochodzi do nadprodukcji amoniaku, który wpływa hamująco na proces metanogenezy.
2. rozmiar cząstek – wpływa na pierwsze etapy fermentacji metanowej – zbyt duże cząsteczki są wolniej hydrolizowane, ponieważ ich powierzchnia właściwa jest mniejsza niż w przypadku cząstek rozdrobnionych.
3. obecność azotu w surowcu – optymalny iloraz węgla do azotu w surowcu wynosi od 10:1 do 25:1 co pozwala na wydają syntezę białek, aminokwasów i ograniczonej syntezy amoniaku. Zbyt wysoka zawartość azotu powoduje nadprodukcję amoniaku, który w wysokim stężeniu działa toksycznie na metanogeny.
4. temperatura – fermentację metanową możemy podzielić na:
   • psychrofilną,
   • mezofilną,
   • termofilną.
5. obecność substancji toksycznych (tlenu – który hamuje wzrost Archae produkujących metan, metale ciężkie) oraz powstawanie inhibitorów metanogenezy: lotnych kwasów organicznych, amoniaku (szczególnie przy nadmiarze związków azotu w surowcu), siarkowodoru.
6. wilgotność surowca.

1. siarkowodór
2. lotne siloksany – w silnikach zasilanych biogazem mogą ulec przekształceniu do tlenku krzemu i osadzać się na elementach mechanizmu.
3. CO2

• filtry gruboziarniste – zatrzymanie większych cząsteczek, substancji stałych i skondensowanej wody,
• przegrody mikroporowate – zatrzymanie kropel wody,
• cyklony – dalsza dehydratacja gazu, oddzielenie wody następuje w wyniku działania siły odśrodkowej,
• łapacze wilgoci i spusty wodne,
• suszarki krzemionkowe,
• suszarki glikolowe – przy zastosowaniu glikolu trietylenowego.

Za pomocą związków żelaza ( dodawanie FeCl do bioreaktora, absorpcja siarkowodoru na złożach tlenków żelaza), za pomocą węgla aktywnego, za pomocą tlenu – jego niewielkie ilości są dodawane do reaktora tak, by siarkowodór mógł ulec utlenieniu do siarki elementarnej przy udziale bakterii z rodziny Thiobacillus.

Fermentacja przebiega w jednym bioreaktorze, co pozwala na prosty sposób prowadzenia procesu i ogranicza koszty, ale nie zapewnia optymalnych warunków fermentacji – muszą one zapewniać odpowiedni wzrost różnych rodzajów mikroorganizmów. Fermentację w procesie jednoetapowym możemy podzielić na mokrą i suchą w zależności od zawartości suchej masy w surowcu dla produkcji metanu. Dla fermentacji mokrej zawartość suchej masy nie przekracza 15%, podczas gdy dla suchej wynosi do 40%.

Technologie jednostopniowej fermentacji mokrej:

1. Niemcy
   • BTA
   • Bio-Stab
   • DSD-CTA
   • Linde/KCA
2. Finlandia
   • Wassa
   • Ecotec
3. Włochy
   • Italba
   • Snamprogetti

Zapewnia różne, optymalne warunki wzrostu poszczególnych grup bakterii biorących udział w fermentacji metanowej. Rozdzielenie procesów składających się na produkcję metanu na różne bioreaktory pozwala na uzyskanie optymalnych warunków w każdym z etapów metanogenezy.

• fermentacja dwustopniowa – rozdział etapów hydrolizy i acidogenezy od etapów acetogenezy i metanogenezy.
• fermentacja dwustopniowa, zmiennotemperaturowa – w jednym z bioreaktorów zachodzą procesy mezofilowe, natomiast w drugim termofilowe.

Wśród procesów dwuetapowych możemy wyróżnić systemy z rozdziałem faz i systemy bez rozdziału faz.

• fermentat – materiał pofermentacyjny, zawiera substancje słabo ulegające biodegradacji oraz dużą ilość substancji odżywczych – w rozkładzie beztlenowym zużyciu ulega C, O oraz H, natomiast w fermentacie pozostaje dużo P, K i N co pozwala na zastosowanie materiału pofermentacyjnego jako nawozu. Fermentat, przed wykorzystaniem jako nawóz, musi zostać odpowiednio przygotowany: odwodniony, kompostowany, mieszany i rozdrabniany.

• filtrat – ciecz osadowa pozostająca po odwodnieniu fermentatu, zawiera wiele składników odżywczych, przez co również może być wykorzystywana jako nawóz.

1. http://en.wikipedia.org/wiki/Biogas
2. http://en.wikipedia.org/wiki/Anaerobic_digestion
3. http://en.wikipedia.org/wiki/Methanogenesis
4. Biologiczne przetwarzanie odpadów, A. Jędrczak, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2007.
5. Brock Biology of Microorganisms, M.T. Madigan, J.M. Martinko, J. Parker – 10th edition