Ashbya gossypii (dawniej Eremothecium gossypii) jest grzybem strzępkowym, patogenem roślin, przenoszonym przez owady – pluskwiaki różnoskrzydłe (Heteroptera) [13]. Został opisany po raz pierwszy w roku 1926, przez Ashby’ego i Nowella, jako „strzępkowe drożdże”, ponieważ zaobserwowali oni, że jego grzybnia przypomina pseudogrzybnię Saccharomyces cerevisiae. Co więcej, spory A. gossypii mają haploidalny genom, a budowa ściany komórkowej jest zbliżona do tej z S. cerevisiae. Ostatecznie, uwzględniając filogenezę rDNA, zaliczono A. gossypii do rodziny Saccharomycetaceae [14].

Ashbya gossypii - zdjęcie z mikroskopu fluorescencyjnego (jądra wybarwione DAPI) oraz zdjęcie hodowli na szalce Petriego. Zdjęcie pochodzi z: http://en.wikipedia.org/wiki/Image:A_gossypii.jpg

Dwadzieścia lat po odkryciu A. gossypii doniesiono o nadprodukcji ryboflawiny przez ten gatunek, co zaczęto wykorzystywać niemal natychmiast na skalę przemysłową. Produkcja ryboflawiny była dominującym obszarem badań dotyczących A. gossypii przez ponad pięćdziesiąt lat od jego odkrycia. Dopiero rozwój technik biologii molekularnej umożliwił spojrzenie na ten gatunek z nieco innej strony. Badano między innymi kariotyp elektroforetyczny, rolę GTPaz we wzroście strzępki, migrację jąder komórkowych czy wzrost polarny strzępki. W 1999 roku przeprowadzono pierwszą transformację [14], natomiast w roku 1995 odkryto bardzo efektywną rekombinację homologiczną u tego gatunku [11]. W odróżnieniu od innych workowców u A. gossypii nie zaobserwowano, aby integracja DNA zachodziła przy braku sekwencji homologicznych. Wykazano natomiast replikację plazmidów zawierających sekwencje ARS (ang. autonomously replicating sequences) pochodzenia drożdżowego [11].

Ashbya gossypii to bliski krewny Saccharomyces cerevisiae. Spośród wolno żyjących Eukaryota ma najmniejszy genom. Poza tym bardzo szybko rośnie na zdefiniowanych mediach i jest podatny na modyfikacje genetyczne. Cechy te sprawiły, że A. gossypii został organizmem modelowym dla badania wzrostu nitkowatego grzybów, a także biologii rozwojowej grzybów [8, 2].

Rozpoczęto projekt poznania genomu A. gossypii, kiedy zauważono wysokie podobieństwo w kolejności i orientacji genów tego gatunku do S. cerevisiae. Pełną sekwencję opublikowano w roku 2004 w Science [2]. Obecnie jest jednym z najlepiej poznanych i najdokładniej opisanych genomów eukariotycznych [14].

Około 95% genów A. gossypii ma swoje homologi u S. cerevisiae, co sugeruje, że podstawowe funkcje komórkowe i mechanizmy morfogenetyczne są konserwatywne w obrębie tych gatunków. Genom A. gossypii jest bardzo kompaktowy, w 8.8Mb jest ponad 4700 genów, rozmieszczonych na siedmiu chromosomach [14]. Porównanie genomów A. gossypii, S. cerevisiae i innego pokrewnego gatunku - Kluyveromyces waltii wydaje się dowodzić tezie, że u przodka drożdży piekarskich nastąpiła duplikacja całego genomu, a następnie utrata niepotrzebnych jego fragmentów [5].

Na stronie http://agd.vital-it.ch/index.html znajduje się przeglądarka Ashbya Genome Database, umożliwiająca korzystanie z bazy danych dotyczących genomu A. gossypii. Została ona opisana w czasopiśmie MBC Genomics: gattiker_2007.pdf

Ryboflawina (witamina B-12) to związek o barwie żółtej, rozpuszczalny w wodzie, prekursor w syntezie koenzymów flawinowych – FMN i FAD, służących jako akceptory elektronów dla oksydoreduktaz. Objawem jej niedoboru może być zapalenie skóry. U człowieka dzienne zapotrzebowanie wynosi 0.3–1.8 mg. Ponieważ nadmiar B-12 jest nieszkodliwy (wydalany z moczem), jest ona dodawana do produktów spożywczych jako barwnik (E101) [10].

Ashbya gossypii jest obok Candida fumata i Bacillus subtilis jednym z trzech najważniejszych producentów ryboflawiny. Zarówno u A. gossypii jak i u C. fumata obserwuje się nadprodukcję ryboflawiny w warunkach naturalnych, jednak w procesach biotechnologicznych używa się mutantów wydajniejszych w syntezie. W hodowli nadprodukcja witaminy B2 objawia się żółtym kolorem kolonii, co jest wykorzystywane w poszukiwaniu najwydajniejszych mutantów. Niestety u grzybów produkcja ryboflawiny jest limitowana ilością prekursora [10]. Dlatego poszukuje się sposobów zwiększenia syntezy prekursorów ryboflawiny, szczególnie GTP, na przykład poprzez znoszenie kontroli przez ujemne sprzężenia zwrotne. Można w ten sposób zwiększyć produkcję ryboflawiny nawet dziesięciokrotnie [4].

Mimo wielu lat intensywnych badań nad A. gossypii ciągle nie jest do końca wyjaśniona funkcja nadprodukcji ryboflawiny. Ostatnio dowiedziono, że ryboflawina chroni spory grzybów przed szkodliwym wpływem promieniowania ultrafioletowego [9]. Nadprodukcja ryboflawiny zaczyna się w momencie przejścia hodowli z fazy wzrostu do fazy stacjonarnej, kiedy hodowla staje się coraz bardziej zagęszczona [8].

Ryboflawina jest syntetyzowana w dość skomplikowanym szlaku metabolicznym, składającym się z reakcji przeprowadzanych kolejno różne enzymy. Na każdy mol syntetyzowanej ryboflawiny, potrzeba 1 mol GTP i 2 mole (ribu-5P). GTP jest przekształcany przez cyklohydrolazę GTP do DARPP, który jest redukowany do DArPP, a następnie deaminowany, w wyniku czego powstaje ArPP. Związek ten jest prawdopodobnie dalej defosforylowany przez nieznaną fosfatazę do ArP. Rybulozo-5-fosforan jest przekształcany przez syntazę DHBP. W ostatnim etapie DHBP i ArPP są łączone przez syntazę lumazyny, a powstający DRL jest w końcu przekształcany przez syntazę ryboflawiny do ryboflawiny (schemat: BIOSYNTEZA RYBOFLAWINY)[10].

• GTP – guanozynomonofosforan
• DARPP – 5’-fosforan 2,5-diamino-6-rybozyloamino-4(3H)-pirymidinon
• DArPP - 5’-fosforan 2,5-diamino-6-rybityloamino-4(3H)-pirymidinon
• ArPP – 5’fosforan 2,5-diamino-6-rybityloamino-2,4(1H,3H)-pirymidynodion
• ArP - 5-amino-6-rybityloamino-2,4(1H,3H)- pirymidynodion
• Ribu-5P - rybulozo-5-fosforan
• DHBP - 4-fosforan 3,4-dihydroksy-2-butanonu
• DRL – 6,7-dimetylo-8-rybitylo-lumazyna

Już na wczesnym etapie badań nad produkcją ryboflawiny przez A. gossypii stwierdzono, że ilość powstałej witaminy ściśle zależy od zastosowanych warunków hodowli - temperatury, pH, źródła węgla i jego stężenia, wieku i objętości inokulum oraz składu pożywki [12].

Obecnie proces biosyntezy ryboflawiny prowadzi się przez 7-8 dni, w temperaturze 32°C (pH 7-8). Źródłem węgla są przede wszystkim oleje roślinne – sojowy lub kukurydziany, ale także sacharydy i n-alkany, natomiast źródłem azotu – hydrolizaty białek, namok kukurydziany, ekstrakt drożdżowy lub wywar gorzelniczy. Na proces produkcji ryboflawiny korzystnie wpływa dodatek glicyny, która jest prekursorem guaniny – zwiększa on wydajność procesu [1].

W zależności o przeznaczenia preparatu ryboflawiny, stosuje się różne sposoby wyodrębnienia jej z cieczy pofermentacyjnej. Jeżeli ma być to pasza dla zwierząt, wystarczy kilka prostych kroków, natomiast w przypadku preparatu spożywczego, a tym bardziej farmaceutycznego, procedura trwa o wiele dłużej i jest bardziej czasochłonna i kosztowna (Rysunek: SCHEMAT PRODUKCJI PREPARATóW RYBOFLAWINY)[1].

Przy zastosowaniu optymalnych warunków, możliwe jest osiągnięcie stężenia ryboflawiny do 15g/l w cieczy hodowlanej [3].

Proces biosyntezy ryboflawiny (sklonowane geny kodujące enzymy: cyklohydrolazę GTP, deaminazę DRAP, syntazę DBP, syntazę DMRL, syntazę ryboflawiny oraz reduktazę HTP, a także ich modyfikacje oraz produkty) opatentowano w 1998 roku (United States Patent 5821090, http://www.freepatentsonline.com/5821090.html)

Produkcja ryboflawiny przez A. gossypii okazała się świetnym sposobem na utylizację odpadów powstających przy produkcji olejów spożywczych. Odpady te są dużym obciążeniem dla środowiska, dlatego próbowano je wykorzystać na kilka różnych sposobów, między innymi jako surowiec do produkcji metanu czy pożywkę dla drożdży. Dużą ich część stanowi zanieczyszczony odpadowym olejem ABE. ABE (ang. Activated Bleaching Earth) to proszek składający się głównie z krzemionki, używany do adsorbowania ciemno zabarwionych odpadów o nieprzyjemnych zapachach. W takiej postaci nie może być powtórnie wykorzystany [7].

Jako, że głównym źródłem w procesie produkcji ryboflawiny przez A. gossypii są oleje spożywcze, postanowiono wykorzystać odpadowy ABE z olejem palmowym do tego procesu (SCHEMAT PRODUKCJI RYBOFLAWINY PRZY UŻYCIU ODPADÓW RAFINERYJNYCH). Uzyskano wysoką zawartość ryboflawiny, natomiast zawartość oleju palmowego w ABE została zredukowana pięciokrotnie, z jednoczesnym jego odbarwieniem [7]. Podobne doświadczenia przeprowadzono przy użyciu odpadów pochodzących z procesu produkcji oleju rzepakowego i uzyskano równie dobre wyniki [6].

1. Podstawy biotechnologii przemysłowej. red. W. Bednarski, J.Fiedurk, Wydawnictwa Naukowo-Techniczne, Warszawa 2007
2. Dietrich FS, Voegeli S, Brachat S, Lerch A, Gates K, Steiner S, Mohr C, Pöhlmann R, Luedi P, Choi S, Wing RA, Flavier A, Gaffney TD, Philippsen P. The Ashbya gossypii genome as a tool for mapping the ancient Saccharomyces cerevisiae genome. Science 2004, 304(5668):304-307.
3. Förster C, Revuelta JL, Krämer R. Carrier-mediated transport of riboflavin in Ashbya gossypii. Applied Microbiology and Biotechnology 2001, 55(1):85-89.
4. Jiménez A, Santos MA, Pompejus M, Revuelta JL. Metabolic engineering of the purine pathway for riboflavin production in Ashbya gossypii. Applied and environmental microbiology 2005, 71(10):5743-5751. jimenez_2006.pdf
5. Martin N, Ruedi EA, Leduc R, Sun FJ, Caetano-Anollés G. Gene-interleaving patterns of synteny in the Saccharomyces cerevisiae genome: are they proof of an ancient genome duplication event? Biology direct 2007, 25:2-23. martin_2007_.pdf
6. Ming H, Lara Pizarro AV, Park EY. Application of waste activated bleaching earth containing rapeseed oil on riboflavin production in the culture of Ashbya gossypii. Biotechnology progress 2003, 19(2):410-417.
7. Park EY, Kato A, Ming H. Utilization of waste activated bleaching earth containing palm oil in riboflavin production by Ashbya gossypii. Journal of the American Oil Chemists' Society 2004, 8(1):57-62.
8. Schlösser T, Wiesenburg A, Gätgens C, Funke A, Viets U, Vijayalakshmi S, Nieland S, Stahmann KP. Growth stress triggers riboflavin overproduction in Ashbya gossypii. Applied Microbiology and Biotechnology 2007, 76(3):569-578.
9. Stahmann KP, Arst HN Jr, Althöfer H, Revuelta JL, Monschau N, Schlüpen C, Gätgens C, Wiesenburg A, Schlösser T. Riboflavin, overproduced during sporulation of Ashbya gossypii, protects its hyaline spores against ultraviolet light. Environmental microbiology 2001, 3(9):545-550.
10. Stahmann KP, Revuelta JL, Seulberger H. Three biotechnical processes using Ashbya gossypii, Candida famata, or Bacillus subtilis compete with chemical riboflavin production. Applied Microbiology and Biotechnology 2000, 53(5):509-516.
11. Steiner S, Wendland J, Wright MC, Philippsen P. Homologous Recombination as the Main Mechanism for DNA Integration and Cause of Rearrangements in the Filamentous Ascomycete Ashbya Gossypii. Genetics 1995, 140(3):973-987.
12. Tanner FW Jr, Vojnovich C, Van Lanen JM. Factors affecting riboflavin production by Ashbya gossypii. Journal of bacteriology 1949, 58(6):737-745. tanner_1949.pdf
13. Wendland J, Pöhlmann R, Dietrich F, Steiner S, Mohr C, Philippsen P. Compact organization of rRNA genes in the filamentous fungus Ashbya gossypii. Current genetics 1999, 35(6):618-25.
14. Wendland J, Walther A. Ashbya gossypii: a model for fungal developmental biology. Nature Reviews Microbiology 2005, 3(5):421-429.

Sake to tradycyjny japoński napój alkoholowy wytwarzany z ryżu. Unikatowa procedura jego produkcji pozwala na uzyskanie rekordowej, jeśli idzie o procesy bez stosowania destylacji, 18-20 procentowej zawartości etanolu w roztworze (1). Składnikami koniecznymi do produkcji sake są ryż, woda, oraz dwa rodzaje mikroorganizmów: grzyb Aspergillus oryzae, zwyczajowo zwana koji, oraz jeden z gatunków drożdży; przeważnie Sacharomyces cerevisiae (3). Charakterystycznym dla wyrobu sake jest dwustopniowy proces produkcji alkoholu etylowego, którego oba etapy w dużej mierze przebiegają jednocześnie. W pierwszym z nich pleśń A. oryzae rozkłada skrobię, główny składnik ziaren ryżu, do cukrów prostych - glukozy, która następnie przekształcana jest na drodze fermentacji alkoholowej prowadzonej przez drożdże S. cerevisiae w etanol (2). To właśnie użycie koji decyduje o powodzeniu całego procesu, jako że drożdże nie potrafią wykorzystać skrobi jako substratu do fermentacji alkoholowej (2).

Procedura wyrobu sake obejmuje szereg etapów zobrazowanych na poniższym schemacie:

1. Mielenie ziaren ryżu. Celem pozbycia się łupiny nasiennej uniemożliwiającej przeprowadzenie hydrolizy skrobi ziarna ryżu poddawane są obróbce mechanicznej. Istotny dla procesu jest odpowiedni dobór użytej siły tak by nie generować zbyt dużej ilości ciepła negatywnie wpływającego na późniejszy proces absorpcji wody (3), oraz nie doprowadzić do rozdrobnienia ziaren co utrudnia fermentację (3). Łupina nasienna zawiera także szereg związków chemicznych; białek i lipidów (5), które wpływać mogą na dalsze etapy procesu (4,5), w tym na walory smakowych sake (3, 5). Przyjęło się określać poziom oczyszczenia ryżu jako procent objętości ziarna przed obróbką. Powszechnie wykorzystywane jest na przykład ziarno 70% (tj. 70 procent objętości ziarna pozostało po etapie mielenia)
2. Płukanie zmielonych ziaren. Celem pozbycia się pozostałego po mieleniu pyłu z łupin nasiennych, zwyczajowo zwanego nuka (3), który w dużym stopniu wpływać może na jakość przygotowanego ryżu (3). Płukanie umożliwia jednocześnie absorpcję wody przez oczyszczone nasiona. W zależności od stopnia oczyszczenia ziaren konieczne jest więc zastosowanie odpowiednich czasów namaczania, krótszych w przypadku ziaren wysoko oczyszczonych, dłuższy dla ziaren gorzej oczyszczonych (3).
3. Gotowanie na parze. Gotowanie na parze pozwala na uzyskanie odpowiedniej konsystencji ziaren ryżu z miękkim wnętrzem i twardszą warstwą zewnętrzną. Po tym etapie uzyskany materiał rozdzielany jest na dwie części, wykorzystywane następnie odpowiednio w dwóch poniższych punktach (3).
4. Przygotowanie koji (Seigiku). Koji przygotowywane jest poprzez rozsianie na masie gotowanych i schłodzonych ziaren pleśni A. oryzae. Tak przygotowany materiał umieszczany jest w pomieszczeniu o podwyższonej temperaturze i wilgotności na okres 36-45h z kilkukrotnym mieszaniem. (3).
5. Przygotowanie wkładu drożdżowego (Moto). Druga porcja gotowanego ryżu wykorzystywana jest do przygotowywania wkładu drożdżowego. Odbywa się to poprzez zmieszanie uprzednio sporządzonego koji, masy gotowanego ryżu, wody oraz porcji drożdży S. cerevisiae, a następnie pozostawiane bez mieszania na okres kilku tygodni w temperaturze 15oC (6).
6. Przygotowanie mieszaniny fermentacyjnej (Moromi). Po tym czasie moto przenosi się do większego naczynia i rozszerza hodowlę w ciągu czterech kolejnych dni trzy razy z rzędu zwiększając dwukrotnie wielkość wkładu. Następnie mieszanina pozostawiana jest na 18-32 dni w zoptymalizowanych wcześniej warunkach
7. Odciskanie (Joso) i filtrowanie (Roka). Masę pofermentacyjną odciska się mechanicznie w celu uzyskania pierwotnego roztworu pofermentacyjnego. Następnie roztwór pozostawia się do sedymentacji i filtruje z użyciem węgla drzewnego w celu nadania barwy i wzbogacenia smaku.
8. Dojrzewanie. Przygotowane w ten sposób sake poddaje się procesowi pasteryzacji a następnie około półrocznemu etapowi dojrzewania. Na tym etapie do roztworu dodaje się dodatkowo wody w celu obniżenia stężenia alkoholu z 20 do około 16 procent.

Mimo iż zarówno w przypadku produkcji wina jak i sake u podłoża leży reakcja fermentacji alkoholowej przeprowadzanej przez drożdże, dynamika oby tych procesów wykazuje nieco inną charakterystykę. Dzieje się tak głównie za sprawą tego, że w przypadku sake proces produkcji etanolu przebiega dwuetapowo.

Wyjściowa mieszanina fermentacyjna sake nie zawiera glukozy. W pierwszy etapie procesu dochodzi do systematycznego wzrostu zawartości tego cukru w roztworze, wskutek hydrolizy skrobi dzięki aktywności amylolitycznej pleśni A. oryzae. Niemal równocześnie zachodzi drugi etap procesu - produkcja etanolu z powstającej glukozy poprzez fermentację prowadzona przez drożdże Sacharomyces. Intensywnie rosnące drożdże zużywają szybko dostarczaną przez pleśń glukozę, co skutkuje utrzymywaniem się stężenia tego cukru w roztworze na stałym, niskim poziomie. Jednocześnie w roztworze notowany jest stały wzrost stężenia alkoholu, aż do rekordowej wartości blisko 20%.

Szereg badań biochemicznych miało na celu poznanie podłoża fenomenu odporności drożdży Sacharomyces cerevisiae na tak drastycznie wysokie stężenie etanolu w pożywce. Badania eksportu poly(A)+ mRNA z jądra, oraz tworzenia się cytoplazmatycznych ciałek P [skupiska nietranskrybowanego mRNA w cytoplazmie w kompleksach z białkami odpowiedzialnymi za jego degradację] (7,8) zdawały się sugerować, że nawet w wysokich stężeniach alkoholu w pożywce komórki Sacharomyces nie są w stanie stresu, jako że przebieg żadnego z tych procesów, będących wyznacznikiem zaburzeń translacji, nie odbiegał znacząco od tego w warunkach nie stresowych. Wyniki globalnej analizy transkrypcji genów Sacharomyces podczas procesu produkcji sake (8) wykazały jednak uruchamianie ekspresji szeregu genów związanych z odpowiedzią stresową, m.in. białek HSP, co wskazuje raczej na aktywny mechanizm odporności drożdży na wysokie stężenie etanolu. Jednym z sugerowanych związków uczestniczących w tym zjawisku jest inozytol. Wykazano, że wysokie stężenie tej substancji w komórkach S. cerevisiae zwiększa ich odporność na wysokie stężenie etanolu. Początkowe etapy produkcji sake przebiegają w warunkach niedoboru inozytolu, jako że enzym - heksafosfataza inozytolu, obecny w zewnętrznej ścianie ziaren i uwalniający inozytol na drodze enzymatycznej degradacji, usuwany jest na etapie mielenia ziaren (4). Skądinąd, wykazano, że warunki ograniczonego stężenia inozytolu w początkowych etapach produkcji sake wpływają korzystnie na produkcję kapronu etylu (5), substancji znacznie wzbogacającej smak i aromat sake, stąd jak się okazuje bardzo ważnym dla produkcji sake jest dobór właściwego poziomu oczyszczenia ziaren ryżu. W późniejszych etapach fermentacji zawartość inozytolu w komórkach sukcesywnie wzrasta wskutek uruchomienia ekspresji genu INOl odpowiedzialnego za biosyntezę myo-inozytolo-1 fosforanu. Sugeruje się, że inozytol wpływa na odporność drożdży na wysokie stężenie etanolu poprzez modulację aktywności pompy protonowej. Aktywne działanie pompy protonowej H+-ATPazy zapobiega zakwaszeniu cytoplazmy wskutek napływu protonów do wnętrza komórki przez błonę komórkową, która uległa częściowemu uszkodzeniu pod wpływem dużego stężenia etanolu (4). Przypuszczalnie, modulacja aktywności pompy odbywa się dwojako: pod wpływem zmiany mikrootoczenia lipidowego pompy H+-ATPazy, wskutek sąsiedztwa tratw zawierających lipidy z główkami inozytolowymi (4), oraz poprzez aktywację tej pompy przez kinazę PKC, w którym to szlaku uczestniczą cząsteczki fosfatydyloinozytolu

Badania podstawowe szybko znajdują przełożenie na próby zastosowania w przemyśle. Jednym z przykładów jest stworzenie odmiany drożdży z podwyższoną odpornością na wysokie stężenie etanolu wskutek zwiększenia w nich ekspresji L-proliny, ważnego czynnika chroniącego przez różnymi rodzajami stresu (6). Innym przykładem jest stworzenie z użyciem technik inżynierii genetycznej odmiany drożdży S. cerevisiae, ekspresjonujących na swojej powierzchni glukoamylazy pleśni A. oryzae (2). Stwarza to możliwość wydajnego przeprowadzenia dwuetapowego procesu produkcji etanolu, przy zastosowaniu nie dwóch, a jedynie jednego mikroorganizmu

1. Y. Murooka, M. Yamshita: Traditional healthful fermented products of Japan, J Ind Microbiol Biotechnol (2008)
2. A. Kotaka, H. Sahara, Y. Hata, Y. Abe, A. Kondo, M. Kato-Murai, K. Kuroda and M. Ueda: Efficient and Direct Fermentation of Starch to Ethanol by Sake Yeast Strains Displaying Fungal Glucoamylases, Biosci. Biotechnol. Biochem. (2008)
3. strona internetowa: www.sake-world.com
4. K. Furakawa, H. Kitano, H. Mizoguchi, S. Hara: Effect of Cellular Inositol Content on Ethanol Tolerance of Sacharomyces cerevisiae in Sake Brewing, Journal of Bioscience and Bioengineering (2004)
5. K. Furakawa, T. Yamada, H. Mizoguchi, S. Hara: Increased Etyl Caproate Production by Inositol Limitation in Sacharomyces cerevisiae, Journal of Bioscience and Bioengineering (2003)
6. H. Takagi, M. Takaoka, A. Kawaguchi, Y. Kubo: Effect of L-Proline on Sake Brewing and Ethanol Stress in Saccharomyces cerevisiae, Applied And Environmental Microbiology (2005)
7. S. Izawa, T. Kita, K. Ikeda, T. Miki, Y. Inoue: Formation of Cytoplasmic P-Bodies in Sake Yeast during Japanese Sake Brewing and Wine Making, Biosci. Biotechnol. Biochem. (2007)
8. H. Wu, X. Zheng, Y. Araki, H. Sahara, H. Takagi, H.Shimoi: Global Gene Expression Analysis of Yeast Cells during Sake Brewing, Applied And Environmental Microbiology (2006)