Blakeslea trispora należy do królestwa grzybów.

Organizm jest saprofitem, żyje na pewnych roślinach tropikalnych, zatem preferuje ciepły klimat. W laboratorium grzyb przechodzi kilka stadiów rozwojowych: spory, nitkowata grzybnia, specyficzny owocnik (fruting body). Strzępki grzyba występują w dwóch postaciach różnoimiennych – (-) i (+), która to forma produkuje **kwas trisporowy** (B i C i spełniają rolę hormonów) który jest, prawdopodobnie w głównej mierze, odpowiedzialny za indukcję wzmożonej produkcji karotenoidów - tego zdania nie rozumiem :). Zatem łącząc ze sobą te dwie strzępki w odpowiednich proporcjach uzyskuje się wydajną produkcję karotenu – wydajność wzrasta około 5-20 krotnie. Syntezę wykorzystującą grzyba miała swoje początki w latach pięćdziesiątych. Doświadczenia wskazały, że pleśń jest nietoksyczna i niepatogenna. Testy toksyczności wykonano na myszach. Przeprowadzono także analizę produktów fermentacji w tym testy immunoenzymatyczne mające sprawdzenie występowania 4 mykotoksyn. Toteż umożliwiło to wprowadzenie karotenu wyprodukowanego przez grzyba do przemysłu spożywczego.

Proces fermentacji przebiega w dwóch zasadniczych etapach. Pierwszy z nich to preferencyjnie tlenowa hodowla wgłębna mikroorganizmu. Glukoza i zmacerowana kukurydza mogą stanowić źródło węgla i azotu – najlepiej gdy substratami są rzeczy tanie i niepotrzebne. W produkcję karotenu są zaangażowane, między innymi opisane, 2 geny carB i carRA, których to produktami są odpowiednio dehydrogenaza fitoenu oraz drugie białko o aktywności cyklazy likopenu i syntazy fitoenu. Otrzymujemy następnie biomasę bogatą w karoten. W drugiej fazie zajmujemy się uzyskaniem pożądanego związku. Ekstrakcję prowadzi się octanem etylu, lub kolejno: octanem izobutylu i alkoholem izopropylowym, następnie jest oczyszczany, zagęszczany i krystalizowany. Ostateczny produkt składa się w znakomitej większości z β- karotenu około 97-98%, produkt spełnia także kryteria czystości narzucane przez FDA.

Produkcja karotenu może przebiegać wydajniej jeśli zastosuje się stymulatory takie jak:

• β-jonon,
• retinol,
• kerosen,
• związki aromatyczne (dimetyloftalan, weratrol),
• azotowe związki heterocykliczne (izoniazyd, iproniazyd).

Wydajność można również zwiększyć około 15 razy wykorzystując surfaktant Span 20 (wpływa w jakiś sposób na produkcję kwasu trisporowego)

Ciekawostką może być karmienie krewetek grzybkiem by miały jakże pożądane zabarwienie.

Największymi firmami produkującymi β- karoten wykorzystującymi owego grzyba zdaje się, że są DSM – kwatera główna w Holandii, która to oferuje kapsułki z karotenem, skrystalizowany proszek, w roztworze 30% oleju słonecznikowego oraz Vitatene – Hiszpania. Karoten jest dostępny w Krakowie w firmie IPRA, niestety nie jest podane jakie pochodzenie ma ów β- karoten, ani też jego stężenie, ale płynny kosztuje około 175 zł a w proszku około 50 zł za kg.

Blakeslea trispora może również produkować inny karotenoid: likopen (czerwony barwnik np. nadający zabarwienie pomidorom). Likopen jest pośrednim produktem w produkcji β- karotenu toteż by faworyzować wytwarzanie likopenu dodaje się imidazol lub pirydynę, morfolinę. Są również aplikacje w których wskazuje się na szczepy grzyba poddane mutagenezie, które nie wymagają podawania inhibitorów syntezy β- karotenu. Grzyb produkuje głównie all-trans-likopen stanowiący około 90% i znacznie mniejsze ilości 13-cis-likopenu, a także β- i γ-karoten. Ekstrakcji dokonuje się przy pomocy izopropanolu i octanu izobutylu. W sprzedaży jest dostępny przykładowo jako 5 lub 20% roztwór likopenu w oleju słonecznikowym.

Poniższa tabela prezentuje przykładowe zastosowania likopenu i maksymalne dopuszczalne dawki.

Produkcja skleroglukanu przez Sclerotium glucanicum została po raz pierwszy stwierdzona przez Halleck’a, który zaobserwował wydzielanie przez grzyba tegoż polisacharydu. Pillsbury Company wprowadziła skleroglukan na rynek pod nazwą handlową Polytran®, który w 1976 został skomercjalizowany przez CECA S.E. (Francja) pod nazwą Biopolimer CS®. Później Satia – oddział francuskiej firmy Mero-Rousselot zaczął produkować skleroglukan pod nazwą handlową Actigum CS6®. Następnie firma Sanofi Bio-Industries (Francja) uzyskała prawa od Satia i CECA i stała się głównym producentem skleroglukanu. Firma Sanofi została nabyta przez firmę Degussa Food Ingredients (Niemcy) w 1995 roku, która rozpoczęła produkcję skleroglukanu pod nazwą fabryczną Actigum®. W 2006 roku firma została przejęta przez inną - Cargill (Niemcy), która produkuje skleroglukan dalej pod tą samą nazwą.

Skleroglukan jest interesującym, posiadającym bardzo szerokie zastosowanie, polisacharydem wydzielanym przez nitkowate grzyby Sclerotium podczas ich wzrostu. Skleroglukan jest obojętnym polisacharydem, w roztworach wodnych skleroglukan jest obecny jako trimer o strukturze helikalnej. Po całkowitej hydrolizie daje jedynie D-glukozę. Polimer ten składa się z głównego łańucha zbudowanego z jednostek β-D-(1-3)-glukopiranosylowych. Do co trzeciej podjednostki dołączona jest reszta β-D-(1,6)-glukopiranosylowa. Struktura skleroglukanu została po raz pierwszy objaśniona z użyciem analizy cyklicznego utleniania, natomiast później zweryfikowana poprzez NMR. Podstawowa jednostka budująca skleroglukan może być przedstawiona następująco:

gdzie n mieści się w zakresie 9000 – 18000.

Długość polimeru jest zależna od użytej kultury grzyba. Średnia masa skleroglukanu wynosi w granicach od (0,13-0,32) do (0,3-6,0) MDa.

Glukan tworzy silne wiązania wodorowe (w środowisku wodnym), jest chemicznie (pH 2-12) oraz termicznie (do 135°C) stabilny. Skleroglukan ma właściwości zagęszczacza, jest ponadto stosowany do leczenia ran, w przeróbce ropy naftowej, oraz jako materiał do opakowań (skleroglukan jako film charakteryzuje się małą przepuszczalnością tlenu).

Skleroglukan jest produkowany i wydzielany poza komórkę przez gatunki: Sclerotium glucanicum, Sclerotium rolfsii oraz Sclerotium delphinii. Corticium rolfsii oraz Schizophyllum commune produkują inne polisacharydy, ale strukturalnie bardzo podobne do skleroglukanu. Głównymi producentami skleroglukanu są Sclerotium rolfsii oraz Sclerotium glucanicum. SA to heterotroficzne, filamentarne grzyby, które są opisywane jako patogeny roślinne oraz pasożyty.

Trzy zasadnicze kroki:

1. pobranie substratu;
2. wewnątrzkomórkowe przekształcenie substratów w skleroglukan;
3. usunięcie poza komórkę.

Istnieje obecnie mało informacji na temat produkcji skleroglukanu w komórkach grzybów. Ale generalnie proces produkcji powinien przypominać w pewnym stopniu produkcję pozostałych glukanów. Najpierw glukoza jest przekształcana w komórce przez heksokinazę, następnie fosforylowana z użyciem fosfoglukomutazy PGM oraz fosfoglukoizomerazy PGI. Fosforylaza UGP katalizuje formowanie UDP-glukozy, która reaguje z transporterami lipidów inicjując proces polimeryzacji. Ten proponowany schemat produkcji skleroglukanu przedstawia poniższy schemat:

Do czynników wpływających na produkcję skleroglukanu należą:

• przygotowanie inokulum
• medium potrzebne komórkom do wzrostu
• warunki środowiskowe

Regulacja wymienionych czynników może prowadzić do zwiększenia produkcji polisacharydu. Poza tym ważne jest również wyeliminowanie aktywności niepożądanych enzymów.

Ilość substratu (jako źródła węgla) przekształconego przez komórkę w polimer zależy w dużej mierze od składu pożywki (w szczególnie niekorzystnych warunkach może dojść nawet do całkowitego zahamowania produkcji skleroglukanu). Optymalny skład medium jest bardzo istotny dla wzrostu mikroorganizmów, stymulacji formowania produktów i dostarczania energii niezbędnej dla przemian metabolicznych.

Pożywka stosowana w hodowli składa się z elementów, które zaspokajają zapotrzebowanie pokarmowe grzybów oraz zapewniają optymalne warunki dla produkcji skleroglukanów. Najważniejsze składniki pożywki:

• glukoza;
• NaNO3;
• KH2PO4;
• kwas cytrynowy;
• KCl;
• MgSO4;
• FeSO4;
• Ekstrakt drożdżowy;
• Tiamina;
• ZnSO4.

Jako źródło węgla najczęściej wykorzystuje się glukozę lub sacharozę, choć inne substraty również mogą być utylizowane. Optymalne stężenie cukru to 30-35 g/l. W tych warunkach maksymalna produkcja skleroglukanu wynosi: 8,5-10 g/l (stosunkowo mało). Stwierdzono, że stężenie sacharozy powyżej 45 g/l hamuje już wzrost Sclerotium glutamicum, a tym samym ogranicza produkcję skleroglukanu. Sytuacja wygląda inaczej w przypadku Sclerotium rolfsii. Stężenie sacharozy 30g/l prowadzi do produkcji skleroglukanu w ilości tylko 7g/l, natomiast trzykrotny wzrost stężenia skleroglukanu (do wartości 21g/l) uzyskuje się, gdy stężenie sacharozy w pożywce wynosi 150g/l. Mimo tego jednak końcowe stężenie sacharozy w pożywce po zakończeniu procesu fermentacji wynosi do 100g/l, co kwestionuje ekonomiczne korzyści takiej strategii.

Azot stanowi od 8-14% suchej masy komórkowej grzybów. Jest składnikiem białek, enzymów i jest niezbędny dla prawidłowego metabolizmu komórek. Jako źródło azotu w pożywce można umieścić np.: jony NH4+, NO3-, ekstrakt drożdżowy, hydrolizat kazeiny. Dodatek azotu generalnie prowadzi do zwiększenia biomasy komórkowej, ale zmniejsza formację glukaniu. Stwierdzono, że zastosowanie azotanu w pożywce daje większy poziom produkcji skleroglukanu niż zastosowanie siarczanu amonu. Jony amonowe zalicza się do inhibitorów enzymów syntezy glukanów.

Dodatek prekursorów cząsteczek jest bardzo ważny w produkcji skleroglukanu. Wyższe wewnątrzkomórkowe stężenie nukleotydo - fosfaranów cukrów w warunkach ograniczonej ilości azotu, zwiększa produkcję skleroglukanu. Również aminokwasy zostały użyte przez niektórych naukowców jako źródło związków azotu oraz jako stymulator produkcji glukanów. Nie ma jednak wystarczających informacji o zastosowaniu aminokwasów jako prekursorów dla produkcji skleroglukanów, chociaż L-treonina jest składnikiem optymalnego medium (ale nie stwierdzono jednoznacznie zwiększenia produkcji skleroglukanu). Inne prace donoszą, iż UMP i UDPG oraz aminokwasy takie jak L-lizyna mogą być stosowane do produkcji skleroglukanów.

Mikroorganizmy odpowiadają na zmiany środowiskowe na wiele różnych sposobów np. poprzez indukcję bądź zahamowanie syntezy białek, zmiany w morfologii komórek, stymulacji bądź zahamowania enzymów. W bioreaktorze najważniejszymi parametrami są:

• pH;
• temperatura;
• szybkość mieszania;
• ciśnienie.

Fizjologia Sclerotium glucanicum była badana przez wielu naukowców pod kątem funkcjonowania i odpowiedzi komórek na warunki środowiskowe , oraz w celu optymalizacji warunków dla produkcji skleroglukanu.

Wewnętrzna temperatura mikroorganizmów musi być równa temperaturze środowiska. Jak wiele reakcji chemicznych, aktywność mikrobiologiczna jest wrażliwa na temperaturę środowiska. Wartość temperatury jest kluczowa zarówno dla wzrostu komórkowego, jak i produkcji polisacharydów. Jednak temperatura optymalna dla produkcji skleroglukanu (tj. 20-37°C) jest różna dla temperatury optymalnej dla wzrostu komórek (28°C). Poniżej 28°C zwiększona jest produkcja kwasu szczawiowego, co wpływa niesprzyjająco na produkcję skleroglukanu.

Kolejnym czynnikiem wyraźnie wpływającym na fizjologię mikroorganizmów jest pH. pH wywiera wpływ na rozpuszczalność składników pożywienia oraz zdolność komórek do ich pobierania, na aktywność enzymów, morfologię błony komórkowej, reakcje oksydoredukcyjne oraz formowanie produktów. pH optymalne dla wzrostu komórek różni się od wartości pH optymalnej dla produkcji skleroglukanu. Moraine i Rogovin zauważyli jednak, iż zmiana pH może bardziej zaburzać produkcję polisacharydów niż wzrost komórkowy. Kang i Cottrell zaobserwowali, iż pH optymalne dla produkcji glukanów wynosi 4,0-5,5. Bazując na tych obserwacjach naukowcy opracowali dwie fazy procesu, z pierwszym stadium optymalnym dla wzrostu komórkowego (pH ok. 2,0), i drugie stadium optymalne dla formowania skleroglukanu (pH podniesione do wartości ok. 5,5). W celu utrzymywania odpowiedniego pH podczas przeprowadzania procesu fermentacji, konieczne jest jego kontrolowanie.

Rozpuszczony tlen odgrywa kluczową rolę w omawianym procesie, gdyż wpływa na aktywność enzymów metabolizmu pierwotnego oraz wtórnego. Może również mieć negatywną rolę w produkcji reaktywnych rodników zagrażających komórkom. Efekt wpływu rozpuszczonego tlenu na produkcję polisacharydów przez S. glucanicum oraz S. rolfsii był wielokrotnie badany przez naukowców. Zaobserwowano, że podczas gdy zwiększona ilość tlenu wpływa korzystnie na wzrost komórkowy, hamuje jednak produkcję glukanów. Wang i McNeil zasugerowali, że proces stymulacji produkcji skleroglukanu w niskim stężeniu tlenu rozpuszczonego może być związane z zahamowaniem wzrostu komórkowego. W tych warunkach więcej substratu było zużywanego do produkcji polisacharydu. W dodatku, niska ilość rozpuszczonego tlenu może powodować zmniejszenie produkcji poprzez zahamowanie oksydazy glikozylowej.

Napowietrzanie oraz wytrząsanie determinują dostępność składników medium oraz rozpuszczonego tlenu dla komórek hodowli oraz kontrolują poziom metabolitów wydzielanych z komórek (w tym: biopolimerów, produktów ubocznych oraz dwutlenku węgla). Podczas fermentacji i produkcji biopolimerów medium staje się coraz bardziej gęste i wykazuje właściwości nienewtonowskie. Zjawisko to utrudnia mieszanie w bioreaktorze oraz zmienia morfologię kultury. Energiczne wytrząsanie i napowietrzanie są zazwyczaj korzystne dla produkcji glukanów. Choć w niektórych przypadkach sytuacja może wyglądać inaczej. McNeil oraz Kristiansen wykazali, że na produkcję skleroglukanu przez S. glucanicum wpływa korzystnie zwiększone wytrząsanie (600 rpm) oraz obniżone napowietrzenie. Ci sami autorzy wskazali również na fakt, iż przy zwiększonym mieszaniu może nastąpić mechaniczne uszkodzenie komórek oraz produkowanego glukaniu.

Kwas szczawiowy jest głównym produktem ubocznym podczas wytwarzania skleroglukanu. Zjawisko to jest niepożądane. Ilość produkowanego kwasu szczawiowego zmienia się i jest zależna od takich czynników jak: źródła związków azotu oraz węgla, sposobu izolacji grzyba, pH, obecności buforów lub innych związków chemicznych obecnych w medium. Najbardziej sprzyjające warunki dla produkcji kwasu szczawiowego obejmują: wysokie stężenie cukrów w pożywce, odpowiednie napowietrzenie, ograniczony dostęp komórek do związków nieorganicznych oraz relatywnie wysokie pH. Maxwell oraz Bateman zasugerowali, iż zmiana wartości pH ma największy wpływ na gromadzenie kwasu szczawiowego. Produkcja tego kwasu jest również bardzo uzależniona od składu pożywki. Wykazano, iż dodatek L-treoniny do medium zmniejsza poziom jego wydzielania. Maxwell oraz Bateman wykryli również brak produkcji kwasu w obecności kwasu D-glukonianu, pirogronianu, asparaginianu bądź glicerolu jako źródła węgla. Poniżej przedstawiono ścieżkę produkcji kwasu szczawiowego u S. rolfsii, sugerowaną przez wielu naukowców:

Optymalizacja parametrów procesu fermentacji nie jest wystarczająca dla zapewnienia wysokiej produkcji skleroglukanu. Następnym bardzo ważnym krokiem po przeprowadzeniu procesu fermentacji jest odzysk produktu. Stosowana metoda jest uzależniona od charakterystyki komórek produkujących oraz pożądanego stopnia czystości wydzielanego skleroglukanu. Jednym ze sposób odzysku jest wysuszenie całego roztworu po fermentacji. Niezwiązane z komórkami produkty mogą również być oddzielone od nich wirowanie różnicowe bądź filtrację. Dodatek acetonu, etanolu bądź alkoholu izopropylowego może prowadzić do precypitacji polimeru i służyć usunięciu wody. Precypitację może ułatwić dodatek elektrolitu (poprzez neutralizację ładunku obecnego na polisacharydzie). Odzysk rozpuszczalnika jest ważny ze względów ekonomicznych. Jeśli to konieczne precypitat może być następnie dalej oczyszczany poprzez rozpuszczenie go w wodzie a następnie odwodnienie oraz wysuszenie. Istnieją trzy zasadnicze techniki przeprowadzania odzysku skleroglukanu, które zostały schematycznie przedstawione poniżej:

„Bulion fermentacyjny” jest na początku neutralizowany z użyciem NaOH lub HCl, następnie trzy- bądź czterokrotnie rozcieńczany dejonizowaną wodą, ogrzewany w temperaturze 80° C przez 30 minut, homogenizowany a następnie wirowany (10000 g, 30 minut). Pelet otrzymany tą drogą jest myty dejonizowaną wodą i suszony w temperaturze 105°C. Supernatant kolejno służy do odzysku skleroglukanu. W I metodzie czysty supernatant jest schładzany w temperaturze 5°C, a potem precypitowany przy użyciu odpowiedniej ilości etanolu (96%) bądź izopropanolu. Precypitacja tą drogą trwa przez około 8 godzin i przeprowadzana jest w temperaturze 5°C. Po precypitacji skleroglukan jest odzyskiwany przy użyciu drobnego sita i ponownie rozpuszczany w dejonizowanej wodzie. Potem następuje dwukrotne oczyszczenie poprzez reprecypitację 96% etanolem. Ostatecznie polimer jest suszony przez 8 godzin w temperaturze 55°C. W II metodzie używane są dwudodatnie kationy (takie jak: jony wapnia, magnezu, żelaza, kobaltu czy niklu. Preferowany jest chlorek wapnia w stężeniu 0,5-2%. Jego dodatek powoduje precypitację szczawianu wapnia, który jest usuwany poprzez filtrację bądź wirowanie. Następnie dodawany jest alkohol izopropylowy bądź etanol w stężeniu 20-40%. Precypitat jest kolejno oddzielany przez wirowanie bądź filtrację. W III metodzie odzysk glukanu następuje poprzez zastosowanie 0,5-2% chlorku wapnia, kolejno dodaje się wodorotlenek metalu w celu zwiększenia pH. Chlorek wapnia, tak jak w poprzedniej metodzie jest wykorzystywany do precypitacji szczawianu wapnia. Precypitat jest zbierany poprzez wirowanie bądź filtrację.

Produkcja skleroglukanu poprzez fermentację jest procesem utrudnionym technologicznie ze względu na wzrost lepkości podczas trwania hodowli. Liczne znane metody produkcji skleroglukanu są albo bardzo kosztowne, albo słabo wydajne. Okazało się, że produkcja skleroglukanu może zostać znacząco polepszona poprzez ciągłą hodowlę Sclerotium rolfsii ATCC 15205 z użyciem odpowiedniej pożywki w warunkach tlenowych. Ciągła hodowla może być prowadzona w bioreaktorach bądź reaktorach chemicznych (z ciągłym mieszaniem).

Przykłady wykorzystywanych reaktorów przedstawia poniższa tabela:

Przegląd bioreaktorów/reaktorów chemicznych stosowanych w ciągłej hodowli Sclerotium rolfsii

Wartość początkowa pH w bioreaktorze powinna zawierać się w zakresie 1,5 – 4 (najczęściej 2-3). Temperatura utrzymywana w bioreaktorze wynosi 22-30° C (najczęściej 25-28°C). Dla przeprowadzenia ciągłej hodowli najczęściej stosuje się bioreaktor BR1. Po założeniu kultury okresowej (w warunkach ograniczonego dostępu tlenu) następuje połączenie bioreaktora poprzez wysterylizowane naczynia z pojemnikiem magazynującym, zawierającym medium (BR 2), które musi zostać uprzednio wysterylizowane. Poziom przepływu świeżego medium w bioreaktorze jest regulowane przez działanie pompy perystaltycznej.

Napowietrzanie sterylnym gazem jest realizowane przy wykorzystaniu pierścieniowej dyszy zamontowanej pod systemem wirnikowym. Każdy reaktor zazwyczaj posiada również cztery przegrody po przeciwnych stronach. Dodatkowo reaktory wyposażone są w urządzenia miernicze i kontrolujące np. temperaturę, pH czy szybkość przepływu.

Cechą charakterystyczną ciągłej hodowli jest stałe dostarczanie świeżej pożywki w ilości równoważnej odprowadzanej zawiesiny. Kultura może być przeprowadzana w stałym stężeniu substratu w warunkach stałej zawartości medium w fazie przejściowej pomiędzy fazą eksponencjalnego wzrostu (masa komórkowa przyrasta eksponencjalnie w czasie) a fazą stacjonarną (stała ilość masy komórkowej).

W warunkach ciągłej hodowli Sclerotium rolfsii skleroglukan jest wytwarzany przez biomasę zawartą w bioreaktorze. Produkcja skleroglukanu jest tu niejako sprzężona ze wzrostem komórek, a więc jest uzależniona zarówno od stężenia biomasy w bioreaktorze jak i poziomu wzrostu.

Hodowle typu ciągłego utrzymuje się w określonej fazie wzrostu. Warunkiem utrzymania równowagi jest ciągłe kontrolowanie szybkości rozcieńczania hodowli D. Wartość ta musi równać się wartości swoistej szybkości wzrostu μ. Kontrola dostarczania pożywienia do bioreaktora realizowana jest na dwa sposoby: turbidostatu i chemostatu (w tym przypadku preferowany jest chemostat). W turbidostatach kontroluje się gęstość optyczną hodowli. W chemostacie natomiast kontroluje się zużywanie np. źródła węgla. Wzrost komórek jest ograniczany zawsze przez ilość substratów w medium. Rezultatem ograniczania substratów dla komórek jest uzyskanie stanu równowagi w rejonie przejściowym między fazą eksponencjalnego wzrostu a fazą stacjonarną.

Jako źródło węgla często stosuje się glukozę. Okazało się, że w hodowli S. rolfsii w warunkach wzrostu z limitowaną ilością glukozy, wydzielane enzymy – glukanazy degradują również skleroglukan. Jest więc to zjawisko zdecydowanie niepożądane. Okazało się natomiast, że zwiększoną produkcję skleroglukanu można uzyskać w warunkach wzrostu z limitowaną ilością tlenu.

W takiej procedurze reakcyjnej:

• poziom przepływu wynosi 0,01 – 0,8 h-1 (preferowane wartości 0,04 – 0,13 h-1);
• szybkość obrotów wirnika wynosi od 30 do 300 rpm;
• poziom napowietrzenia w bioreaktorze – od 0,06 do 2,1 V/VM (objętość powietrza / objętość reaktora⋅minuta);
• parcjalne stężenie tlenu jest redukowane z wartości 100% do praktycznie 0% .

Zamiast warunków z ograniczoną ilością tlenu, można również zastosować warunki z ograniczoną ilością związków azotowych bądź fosforanów.

W przypadku ograniczania ilości związków azotowych, stosunek ilości związków stanowiących źródło azotu organicznego do ilości związków stanowiących źródło azotu nieorganicznego powinno wynosi od 20:80% do 80:20%. Wyższa biomasa komórkowa oraz wyższe stężenie produktów uzyskuje się, gdy stosunek ten wynosi 20:80%. Jako źródło azotu organicznego najczęściej stosuje się ekstrakt drożdżowy, natomiast azotu nieorganicznego – azotan sodu. W warunkach z ograniczoną ilością związków fosforu, jako ich główne źródło stosuje się preferencyjnie diwodorofosforan potasu.

Kolejnym wariantem przeprowadzania ciągłej kultury Sclerotium rolfsii jest bioreaktor z zawracaniem biomasy w warunkach z ograniczoną ilością tlenu. Poziom zawrotu komórek wynosi od 0 do 0,95. Najlepsze wyniki uzyskiwane są, gdy poziom ten wynosi 0,95. Metoda ta pozwala na znacznie zmniejszenie kosztów produkcji skleroglukanu.

Używany materiał:

Mikroorganizm:

• grzyb Sclerotium rolfsii ATCC 15205 (źródło: Amercian Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA)

Przechowywanie hodowli:

• w ciekłym azocie w temperaturze -196°C;
• przechowywanie w temperaturze -80°C jest możliwe przez kilka miesięcy (ale w zmienionych odpowiednio warunkach hodowli: komórki są hodowane w medium StM 3d; następnie zostają zawieszone w roztworze przygotowanym w następujący sposób: 10 g niskotłuszczowego mleka w proszku zostaje rozpuszczone w 60 ml dejonizowanej wody, dodaje się kroplami 10 ml glicerolu i następnie dopełnia do 100 ml dejonizowaną wodą; po sterylizacji 5 ml zawiesiny hodowlanej dodaje się do 5 ml przygotowanego roztworu i przechowuje w temperaturze -80°C);
• tak przechowywane szczepy są następnie wykorzystywane jako inokulum dla pre-kultury.

Pre-kultura:

• dla pierwszej prekultury, 100 ml standardowego medium StdM jest umieszczane w płaskiej butli, a następnie dokonuje się zaszczepienia z użyciem 10 ml inokulum; inkubacja trwa przez ok. 100 h na wytrząsarce, w ciemności, w temperaturze 27°C;
• dla drugiej prekultury – 500 ml standardowego medium StdM jest umieszczane w płaskiej butli o pojemności 2000 ml, następnie dokonuje się zaszczepienia z użyciem 5% objętości pierwszej prekultury; inkubacja trwa przez 75 h, w ciemności, w temperaturze 27°C.

Skład medium:

• Składniki są rozpuszczane w dejonizowanej wodzie; przed zaszczepieniem grzybem Sclerotium rolfsii roztwór jest autoklawowany przez 20 minut w temperaturze 121°C; tiamina i ZnSO4 są dodawane po inokulacji;

Przykładowy skład mediów przedstawia poniższa tabela:

StM: medium do przechowywania szczepu StdM: standardowe medium K-O2: medium dla hodowli ciągłej w warunkach: tlen jako substrat ograniczający wzrost K-N: medium dla hodowli ciągłej w warunkach: związki azotu jako substrat ograniczający wzrost K-PO4: medium dla hodowli ciągłej w warunkach: związki fosforu jako substrat ograniczający wzrost KmZR: medium dla hodowli ciągłej z zawracaniem biomasy w warunkach: tlen jako substrat ograniczający wzrost

Przeprowadzenie ciągłej hodowli:

• Do bioreaktora BR1 następuje wprowadzenie 5% objętości drugiej prekultury i po 2 dniach hodowli okresowej (bez ciagłego doprowadzania pożywki; w warunkach z limitowaną ilością tlenu) następuje połączenie (poprzez 25 l pojemnik przejściowy) bioreaktora BR 1 z 350 l bioreaktorem BR2. Medium w nim zawarte jest wcześniej sterylizowane przez 20 minut w temperaturze 121°C.
• Poziom przepływu medium, temperatura, ciśnienie jest kontrolowane przy użyciu odpowiedniej aparatury.

Podsumowanie:

1. Proces produkcji skleroglukanu jest przeprowadzany z wykorzystaniem hodowli grzyba Sclerotium rolfsii ATCC 15205.
2. Hodowla ma charakter ciągły tzn. że następuje stałe doprowadzanie świeżej pożywki do komórek, ale równocześnie odprowadzanie przyrostu biomasy.
3. Proces jest przeprowadzany w bioreaktorze/reaktorze chemicznym.
4. Standardowa wartość pH w bioreaktorze wynosi 1,5-4.
5. Zakres temperatury panującej w bioreaktorze: 22-30°C.
6. Składniki pożywki są dostarczane w określonej (zdefiniowanej) lub ograniczanej ilości na jednostkę czasu (chemostat).
7. Szybkość przepływu medium: 0,01-0,8 h-1.
8. Szybkość rotacji wirnika: 30-300 rpm.
9. Poziom napowietrzenia: 0,06-2,1 V/VM.

Naturalne polisacharydy, jak również ich pochodne, reprezentują grupę polimerów szeroko stosowanych w przemyśle farmaceutycznym i w niektórych przypadkach odgrywają zasadniczą rolę w mechanizmie i stopniu uwalniania substancji zawartych w lekach podawanych pod różnymi postaciami. Do makromolekuł tych należy zaliczyć również cieszący się coraz większą popularnością skleroglukan oraz otrzymywane z niego pochodne, charakteryzujące się różnymi właściwościami fizyko – chemicznymi. W przemyśle farmaceutycznym Sclg (dzięki biodegradowalności, stabilności chemicznej oraz fizycznej) znalazł zastosowanie jako środek przeczyszczający, składnik osłonek i wypełnień tabletek, substancja stabilizująca zawiesiny, składnik kropli do oczu. Obecnie prowadzone są badania nad zastosowaniem Sclg jako substancji przeciwnowotworowej, przeciwwirusowej oraz przeciwbakteryjnej. Sclg ma zdolność stymulowania odpowiedzi immunologicznej, co również może znaleźć swoje zastosowanie przy produkcji leków.

Natywny skleroglukan

Właściwości fizyko - chemiczne natywnego skleroglukanu wskazują na jego zastosowanie jako nośnika leków stymulującego ich spowolnione uwalnianie.

Tabletki przygotowane z tego polimeru wykazują łatwość pęcznienia, co spowalnia proces dyfuzji zawartych w nich substancji (Rys.1a,b).

Rys.1a Zdjęcie tabletek wykonanych z Sclg zanurzonych uprzednio na okres 3, 7, 12 lub 24 godzin w roztworze o pH = 2. Tabletka referencyjna (w centrum) nie została poddana działaniu niskiego pH. Podobne wyniki otrzymano dla różnych wartości pH.

Rys.1b Schematyczny diagram reprezentujący pęcznienie tabletek wraz z ukazanym wewnętrznym ruchem czoła dyfuzji rozpuszczalnika i uwalnianego leku.

Wstępne badania wykazały, iż Sclg może zostać użyty jako monolityczna macierz. Wygenerowana struktura rentgenograficzna potwierdziła całkowicie amorficzną postać skleroglukanu. Próbka polimeru wysycha bardzo szybko (ok. 5 min.), natomiast ulega hydratacji w przeciągu 1 godziny, dlatego też suszone produkty powinny być odpowiednio zabezpieczane przed wilgocią w celu zagwarantowania ich stabilności podczas przechowywania.

Podczas procesu hydratacji można zaobserwować formowanie powierzchni pęczniejącej, która spowalnia penetrację poprzez medium. Powierzchnia ta jest więc czynnikiem limitującym procesu penetracji wody, a co za tym idzie – uwalniania związków zawartych w tabletkach. Średnica i objętość porów tworzonych w strukturze skleroglukanu podczas procesu produkcji tabletek jest odwrotnie proporcjonalna do siły kompresji, jakiej są one poddawane. Nawet przy maksymalnej wartości użytej siły (50kN) nie dochodzi do zaniku porowatości, co w przeciwnym razie prowadziłoby do rozpadu tabletek. Analiza rentgenograficzna tabletek wykonanych z Sclg wskazuje na podobieństwo pomiędzy strukturą Sclg sproszkowanego oraz zawartego w tabletkach, co wyjaśniałoby, dlaczego nie obserwuje się tworzenia przez Sclg struktury krystalicznej nawet pod wpływem silnej kompresji. Przytoczone wyniki doświadczeń wskazują, iż Sclg może być stosowany wszędzie tam, gdzie istnieje potrzeba użycia materiału wytrzymałego na ściskanie, porowatego oraz wydajnie pęczniejącego. Dodatkowo, można modulować szybkość uwalniania substancji czynnych ze skleroglukanowych tabletek poprzez dodanie do nich innych komponentów – uwalnianie zwiększa dodanie związków hydrofilowych, takich jak guma arabska, natomiast środki hydrofobowe (np. stearynian) zmniejszają ten efekt.

Utleniony skleroglukan

Glukopiranozowy łańcuch boczny skleroglukanu można poddać utlenieniu (jak pokazano na schemtacie 1) na drodze dwustopniowej reakcji, przy użyciu w pierwszym kroku nadjodanu (wytworzenie aldehydowych pochodnych), w drugim – kwasu chlorowego(III), który tworzy pochodne karboksylowe, zwane sclerox.

Schemat Reakcja utleniania Sclg do pochodnych karboksylowych.

Poprzez zastosowanie czynników utleniających i skleroglukanu w różnych stosunkach ilościowych, polimer może zostać utleniony w różnym stopniu. Wykazano, iż sclerox utleniony w stopniu powyżej 60% staje się podatny na czynniki zewnętrzne, podlegając odwracalnej reakcji przejścia zolu w żel pod wpływem zmiany pH. Efekt ten został wykorzystany w badaniach nad zachowaniem się tabletek ze scleroxu w ustroju (Rys.3). Okazało się, iż niskie pH (występujące w żołądku) powoduje spowolnienie uwalniania teofiliny (TPH, leku modelowego) z tabletek (w tym pH dochodzi do utworzenia zabezpieczającej otoczki wokół tabletek), podczas gdy w wyższym pH (środowisko jelitowe) następuje przejście scleroxu z żelu w zol, co pociąga za sobą zwiększenie stopnia uwalniania TPH, który to efekt może zostać zahamowany poprzez dodanie do tabletek substancji kwasowych (np. kwasu cytrynowego).

Rys.3. Wykres zależności uwalniania teofiliny (TPH) z tabletek wykonanych ze scleroxu w funkcji czasu dla dwóch wartości pH (2.0 oraz 6.8). Każda tabletka zawiera 5mg TPH i 100mg scleroxu.

Mimo iż utlenione pochodne Sclg pozwalają na wydajniejsze spowolnienie uwalniania substancji czynnych z tabletek w porównaniu z natywnym Sclg, to efekt ten nie jest wystarczający z punktu widzenia czasu przechodzenia tabletek przez przewód pokarmowy. Dlatego też zastosowano nowe strategie oparte o chemiczne przygotowanie żeli polisacharydowych (hydrożeli) na drodze reakcji tworzenia wiązań krzyżowych w uprzednio utlenionym do aldehydowych lub karboksylowych pochodnych skleroglukanie, co pozwala na otrzymanie bardziej stabilnych struktur trójwymiarowych.

Sieciowany skleroglukan

Substratem do produkcji wspomnianych hydrożeli ze skleroglukanu jest skleraldehyd, produkt pośredni utleniania Sclg, lub sclerox (Schemat 2a i 2b):

Schemat 2a. Otrzymywanie hydrożelu A ze skleraldehydu.

Schemat 2b. Otrzymywanie hydrożelu B ze scleroxu.

Hydrożel wytwarzany ze skleraldehydu o małym stopniu utlenienia (10 do 20%) przyjmuje strukturę sieci złożonej z przypadkowo zorientowanych trójniciowych helis oddziałujących w miejscach występowania grup aldehydowych. Tak więc, w zależności od stopnia utlenienia polisacharydowego substratu, długości czynników sieciujących i stosunku ilościowego reagent/polimer, otrzymuje się produkty o różnych właściwościach. Efektem sieciowania dwóch polimerów Sclg są hydrożele – produkty pęczniejące w różnym stopniu w roztworach wodnych, co w dużej mierze uwarunkowane jest siłą jonową roztworu (Rys. 4):

Rys.4 Wpływ siły jonowej na pobieranie rozpuszczalnika przez hydrożel. (A) roztwór 0.9% (w/v) NaCl, (B) woda destylowana, (C) roztwór 0.9% (w/v) NaCl.

Jak widać, efekt ten jest odwracalny i nowoczesne hydrożele zachowują się jak gąbka – są „wyciskane” przy wzrastającej sile jonowej i w niewyjaśniony sposób „relaksują się” w wodzie destylowanej. Zachowanie to jest bardzo atrakcyjne z punktu widzenia modulacji uwalniania małych molekuł z tabletek poprzez zmiany warunków otoczenia, co stało się podstawą do produkcji „inteligentnych” hydrożeli, systemów „on - off” zdolnych do odpowiedzi na zewnętrzne bodźce, takie jak temperatura czy siła jonowa.

Zgodnie z przewidywaniami, dyfuzja TPH z modelowych tabletek jest spowolniona w roztworach o dużej sile jonowej w porównaniu z wodą destylowaną (Rys.5), w której sieć hydrożelu staje się bardziej rozluźniona z powodu oddziaływań elektrostatycznych pomiędzy naładowanymi grupami. Zwiększając stopień usieciowania otrzymuje się dodatkowe spowolnienie dyfuzji.

Rys.5. Profil dyfuzji TPH z hydrożelowych tabletek umieszczonych w destylowanej wodzie (○) oraz w 0.9% NaCl (w/v) (●).

Współsieciowany skleroglukan

Skleroglukan jest również wykorzystywany do wytwarzania żeli w reakcji współsieciowania z żelanem – innym mikrobiologicznym polisacharydem, charakteryzującym się właściwościami żelującymi w obecności dwuwartościowych kationów, zwłaszcza Ca2+. Jednakże właściwości żelanu nie pozwalają na zastosowanie go jako wypełnienia tabletek, z powodu ulegania szybkiej dyspersji, co powoduje gwałtowne uwalnianie substancji czynnych. Wysoce uporządkowana struktura żelanu skłoniła jednak do badań nad możliwością zwiększenia jego stabilności poprzez połączenie ze skleroglukanem, co w wyniku dało substancję uporządkowaną strukturalnie, podatną na stymulowanie właściwościami środowiska

Reakcja współsieciowania tych dwóch polimerów polega na aktywowaniu grup karboksylowych żelanu w celu przeprowadzenia reakcji z grupami hydroksylowymi Sclg. W tym etapie zostaje zamrożona struktura obu żeli poprzez wytworzenie wiązań kowalencyjnych, co zwiększa ich stabilność. Otrzymana sieć (CCP,ang.Co-Crosslinked-Polymer) wykazuje lepsze cechy związane z modulacją uwalniania substancji czynnych oraz właściwości mechaniczne.

Przeprowadzone badania dynamiki pochłaniania wody wskazały dodatkowo na bardzo dużą szybkość tego procesu (ok.5min.) połączoną ze znikomym zwiększeniem objętości żelu.

Hydrożel skleroglukan/boran

Skleroglukan, podobnie do innych polisacharydów, reaguje z jonami boranowymi, dając strukturę trójwymiarową, która jest tworzona poprzez oddziaływania fizyczne oraz chemiczne. Jak wykazano, jony boranowe nadają sieci sztywności bez większego wpływu na strukturę samego Sclg. Właściwości tego hydrożelu zależą od ilości użytego Sclg w stosunku do boranu. Badania stopnia uwalniania leków z hydrożelu wykazały, iż zależy on od wielkości molekuł substancji czynnych, co wynika z oddziaływań sterycznych. Na tej podstawie zaproponowano strukturę hydrożelu (Rys.6), w której grupy diolowe łańcucha bocznego Sclg reagowałyby z jonami boranowymi, poprzez siły fizyczne i chemiczne, przez co jony te stawałyby się molekułami mostkującymi pomiędzy cząsteczkami Sclg, co wpływałoby na tworzenie tunelowych cząsteczek żelu, w środku których mieściłyby się jedynie małe cząsteczki leków (np. TPH), natomiast duże – klinowałyby się.

Rys.6. Zaproponowana struktura hydrożelu Sclg/boran z umieszczoną wewnątrz kanału cząsteczką TPH.

Skleroglukan znalazł pierwotne zastosowanie w przemyśle paliwowym, kiedy to okazało się, iż wykazuje on większą stabilność od ksantanu w szerokim zakresie temperatur i pH oraz wartości sił ścinających i zanieczyszczeń. Podczas ekstrakcji ropy naftowej Sclg zwiększa lepkość, a co za tym idzie - ciśnienie hydrauliczne, wody morskiej lub solanki używanej w tym procesie, co zwiększa znacząco wydajność ekstrakcji. Dodatkowo Sclg (w formie surowej lub oczyszczonej) nawilża wiertło i zapobiega ciśnieniu wstecznemu generowanemu podczas odwiertów. Sclg jest bardzo użyteczny jako stabilizator i zagęszczacz płuczek wiertniczych, co pozwala na zwiększenie lepkości nawet bardzo cienkich płuczek, na których bez tego nie można by przeprowadzić odwiertów. Właściwości reologiczne płuczek ze skleroglukanem pozostają niezmienione w zakresie temperatur od 20 do 80C. Ze względu na te właściwości prowadzi się badania nad polepszeniem Sclg. Okazało się, iż dodatek cytrynianu cynku jako środka deflokulującego i czynnika dyspergującego do Sclg zwiększało zdolności zagęszczające polimeru, zmniejszało potrzebę rozcieńczania płuczki i zmniejszało koszty zużycia Sclg o 44%.

Przemysł spożywczy na świecie zużywa rocznie 70 000 ton polisacharydów jako czynników zagęszczających i stabilizujących. Obecnie poszukiwani są nowi producenci i wytwarzane przez nich substancje, które mogłyby modyfikować lepkość oraz strukturę produktów spożywczych.

Do tychże substancji należy zaliczyć skleroglukan, który może być używany jako zagęszczacz, czynnik żelujący lub stabilizujący. Jednakże nadal na rynku dominuje ksantan – substancja o podobnych właściwościach, która mogłaby zostać wyparta przez skleroglukan, o ile koszty i wydajność jego produkcji uległyby poprawie, przez co stałby się on przydatny w produkcji dżemów, marmolad, zup, wyrobów cukierniczych, żeli na bazie wody, mrożonek czy produktów nabiałowych (jogurtów, lodów). Skleroglukan byłby szczególnie przydatny podczas procesów produkcji wymagających wysokiej temperatury dzięki swojej termostabilności. Okazało się również, iż Sclg wydajnie przeciwdziała procesowi synerezy bez wpływu na pH, właściwości żelujące, twardość czy kolor substancji, co czyniłoby go dobrym stabilizatorem zapobiegającym utracie wody przez niektóre produkty spożywcze.

W przemyśle kosmetycznym, Sclg może być używany do produkcji lakierów do włosów, kremów, środków zmiękczających skórę i łagodzących podrażnienia. W rolnictwie Sclg jest używany do produkcji aerozoli zapobiegających zakażeniu roślin (wydajna adhezja polimeru do powierzchni liściowej), pestycydów oraz środków ochronnych spłaszczających nasiona. Innymi sugerowanymi zastosowaniami Sclg jest produkcja porcelany, glazury, farb, tuszy oraz pasz.

• „Scleroglucan: Fermentative Production, Downstream Processing and Applications” Shrikant Survase, Parag Saudagar, Ishwar Bajaj, Rekha Singhal; Food Technol. Biotechnol. 45 (2) 107-118 (2007)

• “Scleroglucan: A Versatile Polysaccharide for Modified Drug Delivery” Tommasina Coviello, Antonio Palleschi, Mario Grassi, Pietro Matricardi, Gianfranco Bocchinfuso, Franco Alhaique; Molecules 2005, 10, 6-33

• “Glucans secreted by fungi” Turkish Electronic Journal of Biotechnology Vol 2, p:30-36, 2004

• http://www.freepatentsonline.com/EP1417325A2.html