---

---

Rodzaj Kluyveromyces został utworzony przez van der Walta w 1956 roku, umieścił on w tym rodzaju drożdże wcześniej należące do Saccharomyces.

Kluyveromyces należy do rodziny drożdży Saccharomycetaceae, a te z kolei do gromady Ascomycota. Drożdże należące do gromady Ascomycota rozmnażają się generatywnie, wytwarzając zarodniki wewnątrz askospory, a wegetatywnie rozmnażają się przez paczkowanie wieloboczne. Ściana komórkowa tych drożdży zbudowana jest z trzech warstw, zbudowanych głównie z glukanu i mannanu. Drożdże te nie wytwarzają barwników, a ich biomasa zabarwia się na kolor czerwony pod wpływem błękitu diazoniowego (DBB).

Wyróżniamy wiele rodzaju gatunku Kluyveromyces:

K.dobzhanskii, K. drosophilarum, K. hubeiensis, K. hybrid, K. lactis, K. lactis var. drosophilarum, K. lactis var. lactis, K. lodderae K. lodderi, K. lodderii, K. marxianus, K. marxianus var. dobzhanskii, K. marxianus var. drosophilarum, K. marxianus var. lactis, K. marxianus var. marxianus, K. marxianus var. vanudenii , K. marxianus var. wikenii, K. nonfermentans, K. osmophilus, K. penaeid, K. phaffii, K. phaseolosporus, K. piceae, K. polysporus, K. sinensis, K. thermotolerans, K. vanudenii, K. veronae , K. waltii, K. wickerhamii, K. wikenii.

Krótka charakterystyka poszczególnych gatunków

Kluyveromyces aestuarii:

-izolowany z błota u ujścia rzek

-substratem jest gleba

-warunki wzrostu: na stałym podłożu,GPYA, 25oC

-rośnie w środowisku zawierającym etanol, a nie rośnie w środowisku zawierającym metanol

-nie hydrolizuje mocznika

-optymalną temperatura wzrostu: 25-350C

Kluyveromyces marxianus:

-kolor kolonii: kremowy

-wygląd kolonii: gładki

-rozmnażanie poprzez pączkowanie

-kształt: owalny, okrągły

-nie obserwuje się wzrostu na metanolu, natomiast na etanolu wzrost jest słaby

-nie hydrolizuje mocznika

-optymalna temperatura wzrostu: 25-450C

Kluyveromyces thermotolerans:

-kolor kolonii: biały

-wygląd kolonii: gładki

- rozmnażanie poprzez pączkowanie

-kształt komórki: owalny, okrągły

-optymalna temperatura wzrostu: 12-33oC

Kluyveromyces wickerhamii:

-kolor kolonii: kremowy

-wygląd kolonii: gładki

- rozmnażanie poprzez pączkowanie

-kształt komórki: owalny, długi

-optymalna temperatura wzrostu: brak

Kluyveromyces dobzhanskii:

-kolor kolonii: kremowy

-wygląd kolonii: gładki

- rozmnażanie poprzez pączkowanie

-kształt komórki: owalny, okrągły, cylindryczny

-nie rośnie na metanolu, rośnie na etanolu

-nie hydrolizuje mocznika

-optymalna temperatura wzrostu: 25-35oC

Kluyveromyces lactis:

-kolor kolonii: kremowy, różowy

-wygląd kolonii: gładki

- rozmnażanie poprzez pączkowanie

-kształt komórki: owalny

-nie rośnie na metanolu i zmiennie na etanolu

-nie hydrolizuje mocznika

-optymalna temperatura wzrostu: 25-37oC

Kluyveromyces lactis jest jednym z najważniejszych drożdży pod względem naukowym i biotechnologicznym. Drożdż ten jest z powodzeniem wykorzystywany w przemyśle spożywczym ze względu na bezpieczeństwo stosowania, ponadto jest wykorzystywany do produkcji podpuszczki wołowej i enzymu laktazy rozkładającego laktozę cukier występujący w mleku na skalę przemysłową. Drożdż ten był również wykorzystywany jako białkowy dodatek do żywności w latach 60-tych. W latach 80-tych był jednym z pierwszych drożdży, w którym ustalono system transformacji. Dzięki temu osiągnięciu drożdż ten stał się dogodnym gospodarzem do produkcji obco pochodnego białka. Podpuszczka wołowa była pierwszym białkiem obco pochodnym pochodzącym z wyższego organizmu, które jest produkowane niskim kosztem dzięki zastosowaniu mikroorganizmu. Od roku 1993 aż 8 białek zostało z powodzeniem wydzielonych z tego mikroorganizmu, w kolejnych latach ta liczba ulegała wzrostowi aż do obecnych czasów kiedy prawie 40 transformowanych białek jest produkowanych dzięki K.lactis. Do tych białek zaliczamy np. enterokinazę, lucyferazę, lipazę, lizozym, glukoamylazę, albuminy surowicy ludzkiej, ludzkiej interleukiny-1-beta i wiele innych.

Zalety Kluyveromyces lactis nad innymi drożdżami:

- łatwy do manipulacji genetycznych

- całkowicie zsekwencjonowany genom

-możliwość użycia integrujących i episomalnych wektorów ekspresyjnych

-wzrost następuje na zwykłym podłożu dla drożdży

-enzymy posiadają status GRAS FDA czyli mogą być wykorzystywane w przemyśle spożywczym bez żadnych obaw

-produkowane są zestawy reagentów do łatwego uruchomienia ekspresji pożądanego białka tj. te produkowane przez New England Biolabs z DSM

Heterologiczna produkcja białek w Kluyveromyces lactis Genetyka i fizjologia Kluyveromyces lactis

Kluyveromyces lactis jest doskonałym organizmem modelowym do badania związków pomiędzy genetyką a fizjologią drożdży. Podczas tego typu badań wykazano m.in przewagę procesów oddychania nad fermentacją w porównaniu z S.cervisiae. K. lactis jest przystosowany do warunków tlenowych i jego system oddychania nie podlega represji glukozy w związku z czym K.lactis jest szeroko wykorzystywany w przemyśle do produkcji biomasy i wielu białek. Obecnie gatunek ten jest wykorzystywany także do produkcji heterologicznych białek stosowanych w lecznictwie, wołowej prochymozyny, ludzkiej albuminy i interleukiny. W komórkach tego gatunku, po raz pierwszy u drożdży wykazano, istnienie pozachromosomalnego i pozamitochondrialnego materiału genetycznego. Opisano plazmid m, oraz plazmid warunkujący zdolność „kilerową” K. lactis, czyli powodujący hamowanie wzrostu innych gatunków drożdży.

Wzrost mitotyczny u K.lactis jest głównie ograniczony do haplo-fazy powodując spontaniczne przejścia komórek diploidalnych w mitozę i sporulację. Zawartość par GC w DNA chromosomowym K.lactis sięga 40%, a utrata mtDNA powoduje najczęściej śmierc komorki. K.lactis posiada 6 chromosomów o wielkośc 1-3 Mb i wykazuje wysoką aktywność telomerazy. Niektóre szczepy K. lactis posiadaja dodatkowy cytoplazmtyczny linowy plazmid nazywany „DNA-killer”, gdyż koduje kompleks toksyn antydrożdżowych znany jako zymocyna. System ten zbudowany jest z dwóch genów k1 i k2 które działają zupełnie niezależnie od DNA genomowego.

Rys.1 System DNA-killer

Organizacja plazmidu, genów k1 i k2. Funkcjonalnie powiązane geny mają jeden kolor. Biogeneza zymocyny/immunogenność: niebieski, replikajca DNA: szary, transkrypcja I modyfikacja mRNA: pomarańczowy, nieznane geny: czerwony. Białka terminacji k1 i k2 (TPs) i TIRs: białe/czarne kółka/trójkąty

Efekt Crabtree:

Jedną z korzystnych własności K. lactis pożądaną podczas rekombinacji nadekspresji białek jest tzw. negatywny fenotyp Crabtree. Drożdże Crabtree-pozytywne produkują etanol w warunkach beztlenowych . Produkcja etanolu może być zahamowana przez zmniejszenie ilości węglowodanów w pożywce, ale to odbija się na spowolnieniu wzrostu i syntezy białek. W celu wytłumaczenia tego mechanizmu prowadzono badania nad metabolizmem pirogronianu w K. lactis. Mutantów z zablokowanym genem dehydrogenazy pirogronianowej wykazywały fenotyp Crabtree+ co wskazuje na to że K.lactis jest zdolny do produkcji etanolu w warunkach tlenowych. Z tego wynika, iż cały pirogronian kierowany jest do cyklu Krebsa przez zamianę na acetylo-CoA i tylko wtedy jeśli ten etap jest zablokowany alternatywny enzym dehydrogenza pirogronianu zamienia pirogronian aldehyd octowy i etanol.

Geny RAG i glikoliza:

Nawet jeśli w pożywce jest duże stężenie glukozy, glikoliza K. lactis jest ściśle kontrolowana. Odporność na antymycynę A wykorzystywana jest do selekcji mutantów z uszkodzonym metabolizmem fermatcji (fenotyp Rag). Mutanty Rag są zależne od fosforylacji tlenowej i nie są wstanie rosnąć na glukozie jeśli oddychanie jest zablokowane. Większość genów RAG zaangażowana jest w kontrolę glikolizy. Kodują enzymy glikolityczne, transportery glukozy i regulatory glikolizy. Przy braku inhibitorów oddychania wiele mutantów rag rośnie jednak normalnie. Dlatego uszkodzeniu szlaku glikolizy nie ma większego negatywnego wpływu na wzrost K. lactis w przeciwieństwie do S. cerevisiae. Istnieje kilka wytłumaczeń tego mechanizmu. Po pierwsze enzymy oddechowe nie podlegają silnej represji glukozy, po drugie cykl pentozo fosforanowy umożliwia efektywne obejście blokady w glikolizie. Po trzecie wysoka pojemność biosyntezy pozwala na efektywną akumulację biomasy nawet przy niskiej glikolizie.

K. lactis zdolny jest do wykorzystania laktozy przy braku inny źródeł węgla i jest regulowany wspólnie z metabolizmem galaktozy. Dwa geny kodujące b-galaktozydazę i permeazę laktozy są wystarczające aby S. cerevisiae również zdolne były do wykorzystania laktozy z pożywki.

Kluyveromyces lactis to bardzo ważny i szeroko rozpowszechniony drożdż, jak wcześniej wspomniano zdolny do produkcji wielu enzymów jak laktaza (b-galaktozydaza, enzym rozkładający laktozę, konieczny do produkcji nabiału wolnego od laktozy), czy renina wołowa (enzym proteolityczny kwasu asparaginowego) używanych w przemyśle spożywczym na skalę przemysłową. Chymozyna (renina) wołowa była pierwszym eukariotycznym i heterologicznym enzymem produkowanym w mirkoorganizmach na szeroką skalę. Dostępnych jest szereg technik i narzędzi molekularnych oraz wiele różnych szczepów K.lactis zdolnych do ekspresji białka. K.lactis posiada wiele zalet w porównaniu do innych gatunków drożdży, rośnie na standardowych pożywkach, nie wymaga specialnych fermantatorów, a dodatkowo enzymy produkowane prze K.lactis posiadają status i aprobatę FDA.

K.lactis zdolny jest do produkcji bioproduktów egzogennych, wydzielanych na zewnątrz komórki do środowiska i bioproduktów endogennych zlokalizowanych wewnątrz komórki. Oprócz zastosowania w przemyśle spożywczym K.lactis wykorzystywany jest w przemyśle farmaceutycznym do produkcji takich białek jak interleukina 1-b, interferon aA, b-laktoglobulina, lizozym, czynnik stymulujący wzrost makrofagów (MCSF), albumina surowicza czy prekursor insuliny. Jedynym minusem w produkcji białek przez K. lactis jest inny niż ludzki wzór glikozylacji. Problem ten zostaje rozwiązany przez manipukację drożdży w kierunku wytwarzania enymów procesów ludzkiej glikozylacji.

Wybór odpowiedniego szczepu do produkcji białka podyktowany jest uzyskaniem jak największej wydajności w produkcji konkretnego białĸa. Najczęściej używanym jest szczep K.lactis CBS 2359. W przemyśle każdy szczep jest dodatkowo indywidualnie modyfikowny metodami inżynierii genetycznej do produkcji konkretnych białek. Każdy szczep powinien w swoim genomie posiadać odpowiedni marker selekcyjny, którym najczęściej jest odporność na takie antybiotyki jak genetycyna czy hygromycyna B. Innym sposobem selekcji jest wykorzystanie enzymu acetamidazy z Aspergillus nudilan do przekształcania amidu kwasu octowego do amonikau jako źródła azotu. K. lactis posiada ograniczoną zdolność do prdukcji kawu octowego, więc przeżywają jedynie stransformowane szczepy wykazujące nadekspresję acetamidazy na pożywce z amidem kwasu octowego jako jedynym źródłem azotu.

Wysoka heterologiczna ekspresja genów w K. lactis została osiągnięta przez użycie promotorów z S.cerevisiae oraz możliwości użycia do transformacji zarówno wektorów namnażających sie pozachromosomowo (wektory episomalne) jak i takich integrujących do genomu.

Podczas produkcji białek w K. lactis stosuje się dodatkowe udoskonalenia w genomie drożdży. Modyfikacje genetyczne genomu są dokonywane przez mutagenezę, insercje dodatkowych fragmentów obcego DNA przez rekombinację homologiczną czy integrację ektopiczną. Innym sposobem jest wykorzystanie szczepów wykazujących tzw. 'supersekrecję´. Możliwa jest również nadekspresja białek pomocniczych (chaperonów) pomocnych w fałdowaniu białka albo eliminacja niepotrzebnych czynności życiowych komórki.

Udana ekspresja pożądanego białka wymaga dodatkowo opracowania sprawnych systemów fermentacji na skalę przemysłową, operacji wydzielania, oszczyszczania i zagęszczania produktów. Czasami koniecznym jest dostosowanie tych warunków oddzielnie dla każdego produktu.

Zastosowanie drożdży z rodzaju Kluyveromyces w przemyśle

1. Usuwanie laktozy poprzez fermentację z odtłuszczonego mleka z użyciem Kluyveromyces marxianus.

Kluyveromyces marxianus CBS 6164 wolny bądź immobilizowany na kuleczkach algninianu wapnia 2% jest wykorzystywany do usuwania laktozy z odtłuszczonego mleka poprzez fermentację. Unieruchamianie drożdży w alginianie wapnia jest tanie i łatwe i co najważniejsze nie wpływa toksycznie na metabolizm komórkowy. Metoda ta ponadto jest bardzo korzystna w przemyśle spożywczym, ponieważ zwiększa stabilność komórek, niesie mniejsze ryzyko zakażenia bakteriami, jak również dzięki niej łatwo oddzielić komórki i medium. W warunkach beztlenowych K. marxianus zazwyczaj przekształca laktozę w etanol i CO2, a w mniejszych ilościach lotne związki które następnie są usuwane wraz z CO2 i etanolem z przefermentowanego mleka.

2. Wykorzystanie Kluyveromyces lactis

K.lactis jest z powodzeniem wykorzystywany do produkcji enzymów zarówno tych wydzielanych na zewnątrz komórki jak również tych wewnątrzkomórkowych. Enzym laktaza jest produkowany na szeroką skalę pod nazwą MaxilactTM, posiada on status GRAS więc może być powszechnie używany w produktach mlecznych, dzięki czemu osoby które nie tolerują laktozy mogą spożywać produkty zawierające mleko.

3. Kluyveromyces marxianus

Termostabilny szczep Kluyveromyces marxianus IMB3 jest zdolny do produkcji etanolu, z prostych i złożonych węglowodanów tj. glukoza, celobioza, laktoza, sacharoza, celuloza i skrobia w temperaturze 45 0C.

Kluyveromyces marxianus NRRL Y-7571 został wykorzystany do produkcji iluinazy poprzez fermentację na stałym podłożu (SSF). Wykorzystanie SSF niesie ze sobą wiele zalet m.in. wysoką produktywność, małe wymagania energetyczne, mniejszą produkcję zanieczyszczeń, zwiększona stabilność produktów, niski koszt produkcji. Jako substraty wykorzystywana jest trzcina cukrowa, ponadto wykorzystywane są również SCM i CSL jako źródła węgla i azotu. Kluyveromyces marxianus produkuje endo-PG, który zdaje się być ważny przy rozbijaniu warstwy pektynowej otaczającej ziarna kawy i kakao ponadto jest wykorzystywany podczas konwersji serwatki w etanol.

4. Zastosowanie drożdży “killerowych”

Drożdże killerowe należą do mikroorganizmów wydzielających białkowe lub glikoproteinowe toksyny, które zabijają wrażliwe na nie komórki pochodzące z tego samego bądź pokrewnego gatunku. Zjawisko to może być wykorzystane do zhamowania bądź przedłużenia fermentacji wina, ponadto prowadzi się badania nad konstrukcją szczepów drożdży które można by zastosować jako kultury starterowe do produkcji wina i piwa. Kluyveromyces phaffi produkuje toksynę killerową KpKt, która działa aktywnie na zakażenia drożdży winnych. Drożdż ten wykazuje szerokie działanie przeciwko drożdżom Hanseniaspora / Kloeckera podczas fermentacji win toteż istnieje potencjalna możliwość użycia go jako czynnika konserwującego w przemyśle winiarskim. Obecnie zahamowanie rozwoju zakażeń drożdżami dzikimi otrzymuje się poprzez dodatek SO2 do świeżego moszczu. KpKt wykazuje również aktywność przeciwko drożdżom z gatunków Saccharomyces ludwigii, Zygosaccharomyces bailii oraz Z. rouxii.

5. Kluyveromyces fragilis

K.fragilis jest wykorzystywana do produkcji etanolu, drożdży w proszku, jako składnik odżywczy polepszający karmę dla zwierząt a także jako składnik drożdży spożywczych z serwatki.

Cechy hodowlane:

Drożdże hodowlane przeniesione do pożywki płynnej rozmnażają się, powodując jej zmętnienie. Gdy podziały następują szybko po sobie, komórki drożdży są mniejsze i lżejsze. W miarę zmniejszania się szybkości rozmnażania, komórki zwiększają swoje rozmiary i masę, często tworzą agregaty i opadają na dno naczynia, tworząc osad. W zależności od wielkości komórek i ich regulowanej genetycznie zdolności do flokulacji (tworzenia skupisk komórek), szybkość sedymentacji i konsystencja osadu mogą być zróżnicowane. Opadające komórki adsorbują na swej powierzchni cząstki koloidalne. Tworzy się więc warstwa organiczna ograniczająca dostęp substancji odżywczych i tlenu, co prowadzi do śmierci większości komórek tworzących najgłębszą warstwę osadu. Kolejne warstwy drożdży charakteryzują się już wysoką żywotnością i dobrym stanem fizjologicznym komórek. W przemyśle fermentacyjnym bardzo często środkowa warstwa osadu drożdży wykorzystywana jest jako drożdże zarodowe w kolejnym cyklu technologicznym. Komórki drożdży wprowadzone do rozpuszczonej pożywki z dodatkiem agaru po 2-5 dniach inkubacji tworzą kolonie o zróżnicowanym kształcie, zależnym od umiejscowienia w zastygłej pożywce. Komórki uwięzione na dnie pożywki tworzą duże, płaskie, okrągłe kolonie. Kolonie powierzchniowe są okrągłe lub owalne, ale o mniejszej średnicy. Kolonie utworzone wewnątrz warstwy agarowej są soczewkowate. Powierzchnia kolonii może być gładka, gładka z wyniesieniem na środku, gładka z kraterem na środku, płaska gładka lub pomarszczona, pomarszczona z pseudomycelium wrastającym w pożywkę. Mimo takiej różnorodności typów kolonii, najczęściej klasyfikuje się je jako gładkie S (ang. smooth), pomarszczone R (ang. rough) i śluzowate (ang. mucous). Stwierdzono, że rodzaj powierzchni kolonii jest kontrolowaną genetycznie cechą drożdży i może być dziedziczony bądź też nie.

Warunki rozwoju:

Wegetatywne rozmnażanie drożdży prowadzi do przyrostu liczby komórek w populacji czyli przyrostu biomasy. Do osiągnięcia właściwego przyrostu w odpowiednim czasie konieczna jest obecność podstawowych składników odżywczych we właściwych proporcjach, tj.: wody, źródła węgla i azotu, innych makroelementów niezbędnych do budowy komórki, takich jak fosfor i siarka oraz mikroelementów, a również witamin i innych substancji wzrostowych. Komórki tego są chemoorganotrofami. Mogą się rozwijać w środowisku o zawartości przynajmniej 30% wody. Komórka drożdzą zawiera do 85% wody, występującej zarówno w formie wolnej jak i związanej ze strukturami wewnątrzkomórkowymi. Niezbędne są im także organiczne źródła węgla. Podstawowymi monosacharydami sa: D-glukoza, D-fruktoza i D-mannoza. Disacharydem metabolizowanym jest sacharoza lecz źródła węgla mogą również stanowić sacharydy, niektóre polisacharydy, niektóre kwasy organiczne, alkohole i poliole. Źródłem azotu w hodowlach są najczęściej składniki organiczne wchodzące w skład peptonów, ekstraktu drożdżowego czy brzeczki. Sole nieorganiczne powodują zbyt duże zakwaszenie środowiska, co działa hamująco na komórki. Wyjątek stanowi fosforan amonu, który ma dobre własności buforujące pożywek a ponadto może stanowić źródło fosforu. Jest on istotnym składnikiem pożywki . Najczęściej jest dodawany w postaci fosforanów: KH2PO4 lub k2HPO4.

---

Bibliografia:

„Yeast killer systems” , Walter Magliani, Stefania Conti, Mara Gerloni, Daniela Bertolotti, Luciano polonelli

„Heterologous protein production In the yeast Kluyveromyces lactis”, Albert J.J.van Ooyen, Peter Dekker, Michael Huang, Maurien M.A.Olsthoorn, Denise I.Jacobs, Paul A.Colussi, Christopher H.Taron

„Current status of Kluyveromyces systematic”, Marc-Andre Lachance

„Genetics and Molecular Physiology of the Yeast Kluyveromyces lactis”; Raffael Schaffrath 1 and Karin D. Breunig

„Mikrobiologia techniczna”; Zdzisława Libudzisz, Krystyna Kowal, Zofia Żakowska

mycobank.org

---

---

---

---

Grzybice, mikozy (łac. mycoses) – grupa wysoce zaraźliwych chorób zakaźnych ludzi i zwierząt wywołana przez mikroskopijne grzyby (około 200 gat. z 250 000 opisanych).

Grzybice wywoływane są przez różne rodzaje grzybów: Dermatophyta (Trichophyton, Microsporum, Epidermophyton), drożdżaki (Candida, Cryptococcus), pleśniaki (Aspergillus, Penicillium) oraz grzyby dimorficzne. Wyróżniamy dwa główne typy grzybic: grzybice powierzchniowe pochodne alliloaminy i amcrolfiny,

- antymetabolity,

- pochodne pirydynonu,

- kwasy karboksylowe,

- leki o innej strukturze,

- środki niespecyficzne.

W leczeniu zakażeń grzybowych mimo szerokiej gamy dostępnych preparatów stosuje się najczęściej amfoterycynę B i nystatynę, które należą do grupy antybiotyków polienowych oraz gryzeofulwinę, należącą do grupy antybiotyków o budowie spiranowej. Istnieje również wiele innych powszechnie stosowanych antybiotyków, ale o znacznie mniejszym znaczeniu praktycznym dlatego zajmiemy się głównie omówieniem tych trzech substancji. Dodatkowo, wciąż prowadzone są badania nad produkcją nowych ulepszonych leków przeciwgrzybiczych, które byłyby mało toksyczne, wykazywałyby dużą aktywność antybiotyczną o szerokim spektrum działania przeciwgrzybowego a co więcej charakteryzowałyby się ograniczonym lub całkiem zniesionym indukowaniem odporności.

Antybiotyki polienowe, z których praktyczne zastosowanie znalazły m.in. amfoterycyna i nystatyna, zbudowane są z kilkudziesięcioatomowego pierścienia makrolidowego z dużą liczbą wiązań podwójnych w części hydrofobowej i różną liczbą grup hydroksylowych w części hydrofilowej cząsteczki. Makrocykliczne antybiotyki polienowe łączą się częścią litofilną ze sterolami błony komórkowej powodując zerwanie ciągłości błony (rys. 1) i utworzenie kanałów przez które wydostają się małe cząsteczki i jony co w rezultacie powoduje utratę równowagi osmotycznej i śmierć komórki. Toksyczność tych antybiotyków polega przede wszystkim na ich zdolności do wiązania steroli (głównie ergosterolu) błony komórkowej, które występują zarówno w komórkach grzybów jak i ssaków. Antybiotyki polienowi są trudno rozpuszczalne w wodzie i trudno przechodzą przez błony czy bariery nabłonkowe. Amfoterycyna B jest głównie stosowana ogólnie, lecz w roztworach koloidalnych co znacznie redukuje jej toksyczność (np. kompleks z kwasem deoksycholowym). Nystatyna natomiast podawana jest raczej miejscowo.

rys. 1 Zielone trójglicerydy, niebieskie Amfoterycyna

Synteza antybiotyków polienowych

Prekursor polienów – poliketyd, zbudowany z podjednostek octanowych i propionianowych powstaje w szlaku poliketydowym. Biosynteza polienowego aglikonu związana jest ze szlakiem syntezy kwasów tłuszczowych, gdzie substratami są acylowe pochodne koenzymu A. Pierwszym substratem potrzebnym do produkcji prekursorów antybiotyków polienowych jest glukoza z której w wyniku glikolizy powstaje fofsfoenolopirogronian. Następnie, karboksylaza fosfoenolopirogronianowa katalizująca rekację anaplerotyczną wiązania CO2 przez PEP , przekształca fosfooenolopirogronian do szczawiooctanu, który jest dawcą grupy karboksylowej. Kolejny enzym, karboksylotransferaza metylomalonylo-CoA, prowadzi do powstania propionylo-CoA i metylomalonylo-CoA – bezpośrednich prekursorów łańcucha polienowego. Uważa się, iż dostępność szczawiooctanu jest czynnikiem regulującym syntezę antybiotyków polienowych, a czynnikiem kontrolującym zużywanie prekursorów w kierunku syntezy kwasów tłuszczowych lub antybiotyków polienowych jest zasób NADPH + H+, oraz ilościowy stosunek jego formy zredukowanej do formy utlenionej (NADP+). W fazie intensywnego wzrostu mikroorganizmów występuje wysoki poziom formy zredukowanej i jednocześnie wysoki stosunek NADPH+H+/NADP+ co sprzyja syntezie kwasów tłuszczowych. Sytuacja odwrotna występująca w fazie stacjonarnej promuje produkcję antybiotyków. Przemiany prowadzące do powstania prekursorów koniecznych do biosyntezy aglikonu antybiotyków polienowych schematycznie przedstawiono na poniższym rysunku.

rys. 2

Kompleks enzymatyczny Syntazy Poliketydowej I (białka PKS) koniecznej do powstania szkieletu cząsteczki antybiotyków polienowych w szlaku poliketydowym składa się z trzech domen enzymatycznych zaangażowanych w budowę pierścienia makrolidowego. Enzym Acetylotransferaza (AT) przenosi podjednostki do budowy łańcucha na kolejne białka kompleksu ACP (białko nośnikowe grup acylowych), który dołącza kolejne elementy do łańcucha przy pomocy enzymu ketosyntazy (KS). Dodatkowo kompleks enzymatyczny PKSI posiada trzy domeny o aktywności katalitycznej: ketoreduktazy (KR), dehydratazy (DH) i reduktazy enolowej (ER), których aktywność determinuje prawidłowe dołączenie podjednostek ketydowych. Te trzy domeny odpowiadają za właściwe pojawianie się odpowiednio grup hydroksylowych, podwójnych wiązań i wiązań nasyconych. System PKS w biosyntezie nystatyny i amfoteryczny są bardzo podobne czego można by się spodziewać po strukturalnym podobieństwie tych antybiotyków. Odpowiadające sobie białka wykazują ok. 72% podobieństwo sekwencji. Na rysunku 3 przedstawiono do porównania dwa klastery genów nystatyny i amfoteryczny odpowiedzialne za produkcję białek syntazy PKS.

rys. 3

Reakcje przedstawione rys. 2 osiągają maksymalną szybkość na początku biosyntezy antybiotyku i znacznynają maleć w miarę jego produkcji. Wydajność w produkcji antybiotyku zależy od wyboru odpowiedniego szczepu. Mikroorganizmy mało wydajne różnią się od tych wysoko wydajnych obecnością w znacznie większym stężeniu enzymu tioesterazy, odpowiadającej za degradację reaktywnych form acylo-CoA potrzebnych do szlaku poliketydowego.

Produkcja. Produkcję antybiotyków polienowych rozpoczyna się od zaszczepienia odpowiednich podłoży produkcyjnych uprzednio namnożonym szczepem bakteryjnym. Podłoża te zawierają takie substancje jak nomok kukurydzy, mąkę sojową (źródło azotu), (NH4)2SO4, CaCO3, inne podstawowe składniki mineralne i skrobię oraz glukozę jako źródło węgla. Mimo, iż glukoza jest generalnie najlepszym źródłem węgla do produkcji polienów jej stężenie w podłożu nie powinno przekraczać 15g/l ze względu na represję kataboliczną antybiotyku. Z tego też powodu w większości technologii stosuje się produkcję ciągłą. Ważnym jest utrzymanie niskiego stężenia jonu fosforanowego (2 mmol/l) i kontrola napowietrzenia hodowli. Dodatek octanu, propionianu, n-propanolu czy maleonianu stymuluje produkcję antybiotyków polienowych.

Biosynteza nystatyny jest prowadzono w temperaturze ok. 28oC, nieco wyższej niż w przypadku amfoteryczny (25oC). Technologie produkcji tych dwóch antybiotyków różnią się głównie czasem biosyntezy, dla amfoterycyny jest ok. 4x dłuższy (ok. 192h – 8 dób). Oba antybiotyki gromadzone są wewnątrz komórek, ale w przypadku amfoteryczny część jest wydzielana na zewnątrz co oczywiście wpływa na sposób przygotowania hodowli i sposobu izolacji.

Amfoterycyna izolowana jest z zawiesiny bakteryjnej przez ekstrakcję butanolem lub izopropanolem. Po oddestylowaniu rozpuszczalnika osad przemywa się wodą lub acetonem i suszy pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt izolacji to nie tylko sama Amfoterycyna B, ale również dodatek innych izoform Amfoterycyny A, które ze względu na swoją znikomą aktywność chemiczną traktowane są jako zanieczyszczenia. Ponieważ Amfoterycyna A wykazują większą rozpuszczalność łatwa jest do usunięcia w rozpuszczalnikach organicznych.

Ekstrakcja nystatyny rozpoczyna się od odwirowania lub filtracji grzybni z komórek. Następnie hodowlę podgrzewa się do 70oC, a po usunięciu resztek wody metanolem i odtłuszczeniu grzybni antybiotyk prowadzi się właściwą ekstrakcję antybiotyku metanolem lub mieszaniną metanolu z butanolem. Ekstrakt po odsączeniu od grzybni zatęża się 10-krotnie w wyparce próżniowej, a następnie wytrąca rozcieńczając go wodą i poddaje suszeniu.

Produkcja Amfoterycyny B (United States Patent Offcie, Patent Oct. 13,1959 )

I. FERMENTACJA

- Zbiornikowa fermentacja Streptomyces nodosus

a)Przygotowanie inokulum:

A. Faza pierwsza:

Źródło inokulum: kultura Streptomyces nodosus ze skosów agarowych Gould’a

Pożywka:

3% Staley’s Nutrient 4S

2% glukozy

0,0005% CoCl2•6H20

0,1% CaCO3

pH=7,0-7,2

Sterylizacja: 30 minut w 121oC

Objętość: 100 ml zawiesiny w 0,5l kolbach

Temperatura: 25oC

Inkubacja: 72 godziny na wytrząsarce (170obr./min)

B. Faza druga:

Źródło inokulum: 10% z fazy pierwszej

Medium: jak w fazie pierwszej

Sterylizacja: 40 minut w 121oC

Objętość: 480 ml zawiesiny w 2l kolbach

Temperatura: 25oC

Inkubacja: 48 godziny na wytrząsarce (120obr./min)

b)Warunki fermentacji:

Pożywka:

3% Staley’s Nutrient 4S

2% glukozy

0,25% CaCO3

0,1% NaCl

0,0005% CoCl2

Sterylizacja: 15 minut w 121oC

Objętość: 100 ml zawiesiny w 0,5l kolbach

Temperatura: 25oC

Mieszanie: 0,2 H.P./100gal.

Napowietrzenie: 2,0 ft./min powierzchniowe

Cykl fermentacji: 144 godziny

Wielkość inokulum: 480 ml z kolby fazy drugiej (4%)

Objętość: 12 000 ml

- Fermentacja S. nodosus w kolbach wytrząsanych

Inokulum przygotowuje się jak w przykładzie pierwszym i dodaje się do pożywki fermentacyjnej zawierającej

Mąka sojowa……………………10g

Całe ziemniaki gruntowe…..10g

Dekstroza………………………..10g

CoCl2•6H20…………………….10ml 0,05% r-ru

CaCO3…………………………..1g

Woda destylowana………..1l

Medium sterylizuje się przez autklawowanie w 121oC przez 20 min zaraz przed nałożeniem inokulum. Po czterech dniach przeprowadza się testy na Sacharomyces cerevisiae z porcją zliofilizowanej zawiesiny rozcieńczonej 21/3 raza. Po testach kontynuuje się fermentację dopóki testy nie wykażą pozytywnej aktywności przeciwko Candidia albicans.

II.IZOLACJA

- Ekstrakcja butanolem

Do 9,4 l całej zawiesiny dodaje się ¼ objętości butanolu. pH obniża się do 2 kwasem siarkowym i mieszaninę miesza się przez ok. 30 min. Następnie mieszanię filtruje się przy pomocy dowolnego czynnika filtrującego (np. Hyflo). Po odzieleniu się fazy butanolowej poddaje się ją destylacji pod ciśnieniem w temperaturze nie wyższej niż 35oC. Precypitat jest filtrowany, myty i suszony na wyparce próżniowej. Średnia wydajność z takiej ekstrakcji to 22% i otrzymujemy mieszaninę amphoterycyna A i B. - Ekstrakcja amfoteryczny z grzybni

1l zawiesiny zawierającej amfoterycynę wiruje się aby oddzielić przesącz od grzybni. Grzybnię miesza się z 200ml n-propanolu, obniża pH do 2,0-3,0 przez dodatek kwasu siarkowego i pozostawia na noc w chłodnym pomieszczeniu. Propanol oddziela się przez wirowanie i taką procedurę ekstrakcji powtarza się 3-krotnie ze 100ml porcjami propanolu. Ekstrakt jest zagęszczany w próżni do niewielkich objętości, następnie wirowany i suszony na wyparce próżniowej. Powstały produkt jest rozpuszczany na ciepło w mieszaninie 80 ml n-butanolu, 16ml metanolu i stopniowo dodawanych 80 ml wody. Do mieszaniny dodaje się 46ml heksanu, miesza i pozostawia w temperaturze pokojowej na noc. Formowane są żółte kryształy amfoteryczny, które się filtruje i suszy w desykatorze

- Ekstrakcja z całości mieszaniny

Do danej objętości zawiesiny dodawana jest taka sama porcja izopropanolu. Ph mieszaniny jest podnoszone do 10,5 przez dodatek 20% NaOH. Całość miesza się przez 30min i poddaje filtracji. pH roztworu obniża się do 7 przez dodatek 20% kwasu siarkowego. I usuwa izopropanol w warunkach próżni w temperaturze wyższej niż 35oC. Po całonocnej inkubacji, precypitat jest filtrowany, myty wodą a następnie acetonem i suszony w na wyparce próżniowej. Wydajność tej ekstrakcji sięga 77% i również uzyskujemy mieszaninę amfoteryczny A i B.

III. ROZDZIAŁ AMFOTERCYNY A I B

- krystalizacja alkoholem

Wyekstrahowaną Amfoterycynę umieszcza się w 70% wodnym roztworze izopropylu o obniżonym pH=2. Amfoterycyna B jako substancja nierozpuszczalna jest odfiltrowywana (pH jest podnoszone do wartości 7,5). Po całonocnej inkubacji reszty mieszaniny krystaliczny precypitat Amfoterycyny A jest wymywany acetonem i suszony w próżni. Wydajność AmA sięga 50%.

- krystalizacja przy pomocy dimetylo-formamidu

Amfoterycynę miesza się z dimetylo-formamidem (1g/20ml). Podczas mieszania przez 30 min obniża się pH do 7, następnie mieszaninę filtrujemy, dodajemy jedną objętość metanolu i wody. Mieszaninę o obniżonym pH=4,5 pozostawia się na noc. Precypitat jest filtrowany, myty acetonem i suszony. W ten sposób uzyskujemy produkt zawierający 80-90% amfoteryczny B, 5-10% amfoteryczny A i minimalną ilość zanieczyszczeń. Frakcję zawierająca amfoterycynę B można oczyścić przez 30 minutowe mieszanie z 70% wodnym roztworem izopropanolu (1g/100ml, pH=2). Mieszanię później filtrujemy, ogrzewamy do 45oC, stopniowo podwyższamy pH do 5 i pozostawiamy do ostygnięcia w temperaturze pokojowej na całą noc. Taki produkt jest następnie filtrowany, myty acetonem i suszony co pozwala otrzymać ok. 50% czystej amfoterycyny B. Frakcję zawierającą amfoteryczne A można uzyskać przez 30 minutowe mieszanie z dimetylo-formamidem (1g/20ml), filtrację substancji nierozpuszczalnych i dodanie jednej objętości 50% wodnego roztworu metanolu. Krystaliczny precypitat jest filtrowany, myty acetonem i suszony. W ten sposób uzyskujemy ok. 70-80% amfoteryczny A.

Produkcja Nystatyny (United States Patent Offcie, Patent June 25,1957 )

Na rysunku poniżej przedstawiono przykładowy proces produkcji nystatyny:

AMFOTERYCYNA B jest antybiotykiem makrolidowym heptaenowym izolowanym z hodowli Streptomyces nodosus. Naturalny produkt otrzymywany w skali przemysłowej z kultur S.nodosus ma kolor żółto/pomarańczowyOprócz właściwości przeciwgrzybiczych wykazuje dodatkowo aktywność przeciwko wirusom, pierwotniakom i prionom. Pierścień makrolidowy otrzymany ze szlaku poliketydowego jest hydrolizowany w pozycji C8, do pozycji C19 dodany zostaje cukier mykozamina, a grupa metylowa C41 zostaje utleniona do grupy karboksylowej. Proponowany szlak biosyntezy mykozaminy przedstawia rysunek 4. Wzór chemiczny i budowę cząsteczki amfoteryczny przedstawiono na rysunkach 5 i 6.

rys.4

Amfoterycyna powoduje wiele działań niepożądanych: uszkadza nerki, wywołuje zakrzepowe zapalenie żył, a także reakcje neurotoksyczne. Aby uniknąć tym efektom ubocznym prowadzi się chemiczne modyfikacje oraz wprowadza się nowe formuły wykorzystujące liposomy, emulsje i nanocząsteczki, które zwiększają rozpuszczalność w wodzie, zmniejszają toksyczność i ilość wolnej AmB w krwioobiegu do minimalnych toksycznych stężeń.

NYSTATYNA odkryta przez E.L. Hazen’a i R.F. Brown’a jest makrolidowym antybiotykiem tetraenowym izolowanym ze szczepu Streptomyces noursei. Jak inne antybiotyki polienowi nystatyna oprócz 38 - węglowego pierścienia zawiera mykozaminę przyłączoną do pierścienia za pomocą wiązania b-glikozydowego i grupę karboksylową, które wydają się być istotne dla ich aktywności.

rys. 7 ilustruje chemiczne struktury pochodnych nystatyny produkowanych przez Streptomyces noursei ATCC 11455.

Wczesne badania nad nystatyną udzieliły cennych informacji dotyczących prekursorów biosyntezy nystatyny i czynników wpływających na zwiększenie wydajności. Po sklonowaniu genu odpowiedzialnego za syntezę nystatyny poznano enzymy zaangażowane w ten proces. Sześć białek (Syntazy poliketydowe I) odpowiedzialnych jest za syntezę pierścienia makrolidowego, a takie enzymy jak monooksygenaza p450 i glikozylotransferaza zaangażowane są w dołączanie grup bocznych. Szereg białek NysA-NysL należących do kompleksu enzymatycznego PKS I, o którym wspomnianego przy okazji omawiania ogólnej produkcji antybiotyków polienowych, odpowiada za uzyskanie ostatecznej formy nystatyny. Cały proces rozpoczyna się od reszty kwasu dikarboksylowego przyłączonego do białka NysA zawierającego domeny KS, AT, DH i ACP. Po inicjacji, synteza nystatyny kontynuowana jest przez białko NysB odpowiadające za kondensację dwóch podjednostek propionianu. Obecność nieaktywnej domeny dehydratazy (DH) w białku NysB odpowiada za obecność grupy hydroksylowej na węglu C35 w cząsteczce nystatyny. Biało NysC dodaje sześć podjednostek octanu do wydłużającego się łańcucha poliketydowego. Pięć z sześciu członów NysC zawiera pętle o właściwościach ketoreduktazy (KR) i dehydratazy (DH), a piąta dodatkowo jeszcze jedną domenę ER. Człony 3 i 4 odpowiedzialne są za podwójne wiązania powstałe między C32–C33 i C30–C3, a za podwójne wiązania pomiędzy węglami C26–C27, C24–C25, i C22–C23 odpowiadaja kolejno podjednostki 6, 7 i 8. Z powodu obecności domeny ER w 5 członie, nystatyna jest syntetyzowana jako tetraen.

Za kolejnych sześć rund reakcji kondensacji podczas biosyntezy łańcucha nystatyny odpowiada białko NysI. Podjednostka 11 NysI katalizuje przyłączenie egzocyklicznej grupy metylowej przy wglu C16, który w kolejnych etapach zostaje utleniony do kwasu karboksylowego. Białka NysJ i NysK kończą syntezę łańcucha. Do całkowitego ukończenia biosyntezy nystatyny potrzebne są jeszcze 3 modyfikacje łańcucha poliketydowego. Jako pierwsze następuje utlenienie grupy metylowej przy węglu C16 do grupy karboksylowej, za które najprawdopodobniejodpowiedzialne są dwa geny oksygenazy cytochromu P450 nysL i nysN. Białko NysL odpowiada za hydroksylację węgla C10. Glikozylotransferaza NysDI glikozyluje wiązanie przy węglu C19, a swym działaniem przypomina działanie eukariotycznej UDP-glukoronozylotransferazy. Dwa pozostałe enzymy dehydrataza NysDIII i aminotransferaza NysDII zostały najprawdopodobniej włączone do metabolizmu pierwotnego. Białka NysH i NysG odpowiadają za aktywny transport nystatyny na zewnątrz organizmu. Białka te reprezentują typ III transportera ABC. Wyżej opisany proces biosyntezy nystatyny schematycznie ilustruje rysunek 8 przedstawiony poniżej.

rys. 8

Produkcja nystatyny może być regulowana przez wiele czynników. Głównie aktywatory transkrypcji t.j. NysRI, II, III i IV, które konieczne są do efektywnej produkcji w S. noursei.

GRYZEOFULWINA jest jedynym nieopolienowym antybiotykiem przeciwgrzybowym mającym duże znaczenie lecznicze. Została ona wyodrębniona z hodowli Penicillium griseofulvum już roku 1939. Po wstępnym okresie stosowania do ochrony roślin przed grzybami fito patogennymi, pod koniec lat pięćdziesiątych gryzeofulwina znalazła uznanie w leczeniu grzybic ludzi. Ma strukturę połączonych pierścieni, w tym jednego aromatycznego, i jest interesującym przykładem związku o budowie spiranowej.

Rys. 9 Wzór strukturalny gryzeofulwiny.

Dwa pozostałe pierścienie mają wspólny pojedynczy atom węgla, stanowiący centrum asymetrii, drugi atom chiralny znajduje się w położeniu 6’. Biologiczną aktywnością obdarzony jest związek optycznie czynny o konfiguracji absolutnej 2(S) i 6’(R). Ma on budowę 7-chloro-4,6-dimetoksy-3-oksokumaryno-2-spiro-1’-(2’-metoksy-6’-metylo-4’-oksocykloheksa-2’-enu).

Gryzeofulwina należ do związków trwałych i trudno rozpuszczalnych w wodzie. Podaje się ją doustnie. Jest szczególnie skuteczna w leczeniu grzybicy skór, włosów i paznokci. Aktywność przeciwgrzybowa tego leku jest duża (MIC poniżej 0,5 g/ml). Antybiotyk charakteryzuje się ponadto dobrą wchłanialnością i stosunkowo małą toksycznością.

Mechanizm działania gryzeofulwiny nie jest całkowicie poznany. Przypuszczalnie powoduje ona zaburzenia w syntezie chityny, znajdującej się w ścianach komórek grzybów, ale może także hamować syntezę białek i replikację DNA, blokując podziały komórkowe.

Biogeneza gryzeofulwiny

W początkowym etapie biogeneza gryzeofulwiny jest podobna jak kwasów tłuszczowych oraz układów makrolidowych, w tym również polienowych. Mechanizm kondensacji jednostek octanowych w 14-węglowych łańcuch poliketonowy polega na przyłączaniu kolejnych 6 cząsteczek malonylo-CoA do 1 cząsteczki acetylo-CoA (starter) z udziałem kompleksu wieloenzymowego, analogicznie do syntezy kwasów tłuszczowych.

Rys. 10 Biogeneza gryzeofulwiny

Od tego miejsca szlak biosyntezy gryzeofulwiny charakteryzuje się już dużą odrębnością. Do powstałego łańcucha poliketydowego (wzór I na powyższym schemacie) przyłączane są najpierw dwie grupy metylowe, których dawcą jest metionina, po czym następuje cyklizacja dwóch pierścieni (pierścień A). Powstały gryzeofenon B (wzór II), z udziałem drugiego kompleksu wieloenzmowego, w kilku kolejnych etapach ulega przekształceniu do gryzeofulwiny. Są to reakcje:

1.Przyłączania trzeciej grupy metylowej (do pierścienia A).

2.Częściowe uwodornienie pierścienia C.

3.Wewnętrzna kondensacja pomiędzy pierścieniami A i C, w wyniku której powstaje trójpierścieniowy układ kumaronowy określony nazwą gryzan.

Biosynteza gryzeofulwiny

Biosyntezę gryzeofulwiny prowadzi się w podłożu zwierającym: namok kukurydziany, (NH4)2SO4, KH2PO4, MgSO4; początkowe pH 5,0-5,5. Pod koniec pierwszej doby, przy wyczerpaniu się związków węgla zawartych w namoku kukurydzanym, hodowlę zasila się okresowo lub w sposób ciągły roztworem glukozy. Poza glukozą dobrymi pożywkami węglowymi mogą być: sacharoza, laktoza i skrobia. Od rodzaju użytego węgla zależy optymalne stężenie pożywki azotowej oraz zapotrzebowanie komórek na tlen. Duże stężenie źródła węgla i azotu powoduje konieczność bardzo silnego napowietrzania.

Proces prowadzony jest przez 7-10 dób, w temperaturze 25°C, przy optymalnym odczynie podłoża w fazie produkcji – nieco poniżej pH 7. Gryzeofulwina gromadzi się wprawdzie głównie wewnątrz komórek, ale część produktu jest wydzielana do podłoża.

Gryzeofulwina w glebach

Badając czynniki mające wpływ na produkcję leku przez Penicillium nigricans zwrócono uwagę na ich występowanie w kwaśnych bielicach oraz w ziemiach ogrodowych. Zasadniczym wymogiem produkcji gryzeofulwiny przez te organizmy w obu typach gleb jest sterylizacja oraz wzbogacenie w związku organiczne. Wykazano, że zwykła ziemia ogrodowa jest lepszym medium dla rozwoju organizmów Penicillium nigricans. Poziom gryzeofulwiny w glebach malał w przypadku zainfekowania podłoża przez inne mikroorganizmy. Udowodniono, że po dodaniu leku do świeżej gleby ilość gryzeofulwiny szybko maleje po czym wywnioskowano, że istnieje zjawisko biologicznej degradacji tego antybiotyku w glebie.

Gryzeofulwina w roślinach

Lek ten został wyizolowany z tkanek bobu (Vicia faba), rośliny rosnącej w medium zawierającym antybiotyki i wykorzystującej chloroform oraz octan etylu jako rozpuszczalnik.

Produkcja na skale laboratoryjną

Jak wcześniej wspomniano, gryzeofulwina została po raz pierwszy wyizolowana ze szczepu Penicillium griseofulvum choć dowiedziono, że tą zdolność posiadają także mikroorganizmy Penicillium janczweskii. Optymalne stężenie chlorków w odpowiedniej produkcji gryzeofulwiny określa się na przedział między 0,005 a 0,01% KCl a szacunkowa ilość produkowanego antybiotyku w kulturach mieszanych (wstrząsanych) wynosi około 0,2kg/m3.

Szczepy Penicillium griseofulvum, Penicillium nigricans i Penicillium patulum porównano ze sobą ze względu na ich zdolność do syntezy interesującego nas antybiotyku w zanurzonych, wstrząsanych kulturach. Najbardziej wydajnym organizmem okazał się Penicillium griseofulvum. W innym doświadczeniu, badając rosnący wpływ poziomu azotu (do 4-5 kg/m3) stwierdzono, że ilość otrzymywanej gryzeofulwiny wzrasta do 11kg/m3. Porównano także zależność produkcji leku od pochodzenia węgla w podłożu, na którym rosły organizmy Penicillium griseofulvum. W medium zawierającym laktozę poziom otrzymywanego antybiotyku wynosił jedynie 0,27 kg/m3, natomiast stosując glukozę, wartość ta wzrosła do 0,65 kg/m3. W każdym przypadku wyniki oceniono po 35 dniach. W medium zawierającym sacharozę poziom otrzymanego antybiotyku nie przekroczył 0,55 kg/m3.

Produkcja na skale masową

Na wysoką skale produkcja gryzeofulwiny przeprowadzana jest w tlenowych warunkach. W objętości 600cm3 medium zawierającego serwatkę w proszku (zapewniającą 3,5% laktozę oraz N), 0,4% KH2PO4, 0,05% KCl, które zostało zautoklawowane zaobserwowano znaczna poprawę produkcji leku. Przechowywanie tak przygotowanej podłoża w 25°C przez 7 dni skutkowało powstaniem zawiesiny zawierającej 18*106 bakterii/cm3.

Czynniki mające wpływ na produkcję gryzeofulwiny

1. AZOT:

Badania nad wpływem zawartości azotu w medium w trakcje produkcji antybiotyku przeprowadzono na Penicillium nigricans. Eksperyment prowadzono w pożywkach zawierających takie same wartości glukozy, KCl, KH2PO4, CaCO3 oraz różne stężenia (NH4)2SO4 w zakresie 0,02-0,5 % azotu. Gdy zawartość azotu była mniejsza niż 0,04% bądź większa niż 0,4% produkcja gryzeofulwiny była zahamowana przez azot. Dobrym źródłem azotu dla tych organizmów jest gluten, jednak lepsza w tym wypadku okazuje się mieszanina glukozy i NaNO3.

2.TEMPERATURA:

Zakres temperatury został zbadany na organizmach Penicillium nigricans, zawiera się on w przedziale 28-28,6°C.

3.pH:

Największą ilość otrzymanego antybiotyku (0,81 kg/m3) gdy zakres pH został utrzymany w zakresie od 5,5 do 6.

---

---

Bibliografia:

„Studies on production od griseofulvin: V. Vemkata Dasu, T. Panda

„Biosynthesis of the polyene macrolide antibiotic nystatinin Streptomyces noursei” ; Espen Fjærvik . Sergey B. Zotchev; Appl Microbiol Biotechnol (2005) 67: 436–443

„Amphotericin B”; A. Lemke . A. F. Kiderlen . O. Kayser; Appl Microbiol Biotechnol (2005) 68: 151–162

„Polyene antibiotic biosynthesis gene clusters”; J. F. Aparicio, P. Caffrey, J. A. Gil, S. B. Zotchev; Appl Microbiol Biotechnol (2003) 61:179–188

„Studies on production of griseofulvin”; V. Venkata Dasu, T. Panda; Bioprocess Engineering 21 (1999) 489±495 Ó Springer-Verlag 1999

„Streptomyces nodosus sp. – the amphotericin – producing organism”; William H.Trejo and R.E. Bennet

„Biotechnologia i chemia antybiotyków”; Chmiel Aleksander i Grudziński Stefan

„Studies on production od griseofulvin” V. Vemkata Dasu, T. Panda