Charakterystyka rodzaju Zymomonas
Identyfikcja
Zymomonas to gram-ujemne pałeczki o wymiarach 1,5-2 Χ 4-6μm. W swoim środowisku naturalnym (w glebie lub w fermentujących sokach roślinnych strefy subtropikalnej, gdzie przedostają się z gleby) występują jako pojedyncze komórki albo tworzą kolonie. Spośród tych ostatnich część formuje rozety, część łańcuchy, a pozostałe to kolonie filamentarne (najdłuższe osiągają do 28 μm).
Rys.1. Pojedyncze komórki Zymomonas mobilis pochodzące z kolonii rozbitej przez wirowanie (źródło: Electronic Journal of Biotechnology 2002, Vol. 5 No. 3, Issue 15)
Znane są dwa szczepy Zymomonas mobilis: 17.1 i 17.3 o interesującej morfologii. Mają one komórki U-kształtne zamiast pałeczkowatych.
Większość szczepów nie posiada zdolności do aktywnego ruchu, natomiast 30% posiadających tę zdolność szczepów jest zaopatrzona w 1 do 4 flagelli.
Bakterie rodzaju Zymomonas charakteryzują się zdolnością do produkcji etanolu. Fermentacja heksoz (glukozy lub fruktozy) przebiega w mało wydajnym energetycznie szlaku Entnera-Doudoroffa, którego schemat przedstawiono poniżej. Prowadzi on do powstania 2 moli etanolu, 2 moli CO2 i 1 mola ATP.
Rys. 2. Szlak Entnera-Doudoroffa (źródło: Textbook of Bacteriology)
Przejdź do: Textbook of Bacteriology
Bakterie te zalicza się do względnych beztlenowców – tlen nie jest im potrzebny do wzrostu ani produkcji etanolu, jednak jego obecność w większości przypadków nie jest szkodliwa. Zaobserwowano jednak znaczny spadek wydajności produkcji etanolu w warunkach tlenowych w porównaniu z warunkami beztlenowymi. Dzieje się tak na skutek powstawania produktów ubocznych, takich jak octan czy mleczan.
Do identyfikacji Zymomonas przydatna jest też informacja o zawartości nukleotydów guaniny+cytozyny – jest to 47.5 to 49.5%.
Hodowla bakterii
Bakterie rodzaju Zymomonas można hodować min na
- Medium standardowym z dodatkiem 0,5% ekstraktu drożdżowego + 2% glukozy + 2% agaru (opcjonalnie),
- Medium wzbogaconym sokiem jabłkowym lub piwem,
- Medium syntetycznym.
Na podłożu stałym bakterie z rodzaju Zymomonas tworzą kolonie wgłębne: warstwowe, regularne, o wyraźnie zaznaczonej granicy, białe lub kremowe, o średnicy 1-2 mm po dwóch dniach hodowli. Kolonie powierzchnowe są rozproszone, także o wyraźnie zaznaczonej grnicy, wypukłe o średnicy 3-4 mm. Tylko szczep 6 TH Delft Z. mobilis tworzy kolonie o postrzępionych, nieregularnych brzegach.
Do wzrostu Zymomonas wymagają w pożywce obecności cukru zużywanego w procesie fermentacji tj: glukozy lub fruktozy. Z. mobilis do wzrostu wymaga pantotenianu, a niektóre szczepy dodatkowo biotyny i liponianu. Ponadto hodowany na podłożu z sacharozą produkuje polisacharyd - lewan – zbudowany z reszt D-fruktozy połączonych wiązaniami b-2,6-glikozydowymi.
Wszystkie opisane szczepy Zygomonas charakteryzują się wzrostem w temperaturze 30˚C, hodowla w wyższych temperaturach może służyć jako narzędzie do selekcji określonych szczepów. W temperaturze 40˚C obserwuje się zahamowanie wzrostu niemal wszystkich poznanych szczepów, a za punkt śmierci cieplnej przyjmuje się 5 minutową ekspozycję na temperaturę 60˚C.
Jedynym szczepem rodzaju Zymononas dostępnym w Katalogu Mikroorganizmów Polskiej Kolekcji Szczepów jest Zymomonas mobilis subsp. mobilis PCM 2120.
Produkcja etanolu
Przez ostatnie kilka lat zużycie ważnych dla energetyki surowców takich jak gaz, ropa czy węgiel rosło w bardzo szybkim tempie. Dlatego zaczęto rozważać alternatywne źródła energii, do których zalicza się między innymi etanol. Niektóre procesy biologiczne pozwalają otrzymywać etanol w dużych ilościach.
Tradycyjnie etanol jest produkowany przy użyciu różnych szczepów drożdży, które nie tolerują dużych ilości etanolu. Zmusiło to do poszukiwania gatunków i szczepów tolerujących środowisko zawierające alkohol. Zymomonas mobilis wydaje się właśnie być takim alternatywnym gatunkiem. Badanie wykazują dużą przewagę nad wieloma szczepami drożdży. Między innymi zaletami Z.mobilis w porównaniu z drożdżami są:
- pobieranie większej ilości cukrów
- większa wydajność produkcji etanolu
- niższa produkcja biomasy
- wyższa tolerancja na etanol (źródło: http://www.ias.ac.in/currsci/jul10/articles14.htm )
- nie potrzebuje dodatku tlenu podczas fermentacji
- łatwo nadaje się do manipulacji genetycznych
Jedyną wadą Z.mobilis jest ten fakt, iż fermentacja alkoholowa jest ograniczona do glukozy, fruktozy i sacharozy. Produkcja etanolu zachodzi w szlaku Entnera-Deudoroffa (Rys. 2), dla którego wyjściowymi substratami właśnie są glukoza lub fruktoza. D-glukoza i D-fruktoza pobierane są przez bakterie za pomocą ułatwionej dyfuzji. Stężone roztwory glukozy nie hamują aktywności enzymów szlaku Entnera-Deudoroffa, ponieważ konwersja glukozy do etanolu zachodzi bardzo szybko. Badania wykazują, że enzymami limitującymi są dehydrogenaza glikozo-6-fosforanu oraz fosfoglicerolomutaza. Kluczowymi enzymami dla produkcji etanolu są dekarboksylaza pirogronianowa oraz dehydrogenaza alkoholowa. Dekarboksylaza jako kofaktora potrzebuje fosforanu tiaminy dehydrogenaza natomiast jonów cynku lub żelaza. Ta druga (zależna od żelaza) zachowuje aktywność w wysokim stężeniu alkoholu.
Obecnie próbuje się wyprodukować szczepy które potrafią wyprodukować etanol z substratów bezpośrednio pochodzących z rolnictwa. W celu otrzymania etanologennych szczepów utylizujących takie substraty posługuje się technikami rekombinacji DNA, a mianowicie probuje się transformować Z.mobilis pożądanymi genami innych mikroorganizmów lub lub transformować inne bakterie genami pochodzącymi z Z.mobilis i zaangażowanymi w produkcję etanolu. Genetyczne manipulacji z Z.mobilis pozwalają rozszerzyć zakres substratów do celulozy, serwatki i skrobi. Osiąga się to przez transformacje Z.mobilis odpowiednimi hydrolazami (np. α-amylazą lub β-glukozydazą).
Udział hemicelulozy będącej składnikiem roślinnych ścian komórkowych może wynosić do 40% w resztkach roślinnych dlatego byłaby ona też interesującym substratem wyjściowym do produkcji etanolu. Produktem kwaśnej lub enzymatycznej hydrolizy hemicelulozy jest mieszanina heksoz, D-arabinozy i D-ksylulozy. Transformując Z.mobilis genami kodującymi izomerazę ksylulozową, ksylulokinazę, transketolazę i transaldolasę można otrzymać do 86% wydajności produkcji etanolu. Skonstruowano operon pet dla produkcji etanolu i mieszczono pod kontrolę promotora lac. Zawiera on dwa geny pochodzące z Z.mobilis – pdc oraz adhII, kodujące odpowiednio dekarboksylazę pirogroninową oraz dehydrogenaze alkoholową zalezną od żelaza. Konstrukt taki został wprowadzony do E.coli. Zrekombinowane tak bakterie produkowały duże ilości alkoholu lecz były słabo odporne na etanol. Mutagenezę można też stosować w kierunku otrzymywania szczepów opornych na rożne stresowe warunki środowiska. Chodzi tu przede wszystkim o wysoką temperaturę, niskie pH oraz wysokie stężenie etanolu.
Obecnie również próbuje stosować Z.mobilis z jakimś innym mikroorganizmem (np. drożdżami) produkującym hydrolazy węglowodanowe lub nawet koimmibilozować`(np. w κ-karageenanie) bakterie już z wyizolowana hydrolazą. Takie podejście umożliwia rozkład złożonych polisacharydów do produktów podatnych na utylizację przez Z.mobilis.
Bibliografia
- Swings J, De Ley J. Biology of Zymomonas. Bacteriological Reviews 1977, 41: 1-46.
- Horst W, Doelle A, Kirk L, Crittenden R, Toh H, Doelle M. Zymomonas Mobilis—Science and Industrial Application . Critical Reviews in Biotechnology 1993, 13: 57 - 98.
Zastosowanie przemysłowe rodzaju Mucor
Taksonomia rodzaju Mucor:
- Nadkrólestwo: Eukaryota (jądrowe)
- Królestwo: Fungi (grzyby)
- Gromada: Zygomycota (sprzężniaki)
- Klasa: Zygomycetes
- Rząd: Mucorales
- Rodzina: Mucoraceae
- Rodzaj: Mucor
Pleśnie należące do rodzaju Mucor są odpowiedzialne m.in. za psucie artykułów spożywczych , szczególnie owoców i chleba. Jednak kilka gatunków rodzaju Mucor znalazło zastosowanie w biotechnologii na skalę przemysłową.
Rys.3. Pleśń rodzaju Mucor (źródło: http://en.wikipedia.org/wiki/Image:Mucor.mucedo.-.lindsey.jpg)
Procesami, w których się wykorzystuje są pleśnie rodzaju Mucor, są:
- scukrzanie skrobi
- dojrzewanie serów
- produkcja enzymów
- produkcja związków lipidowych
Scukrzanie skrobi
Scukrzanie (nie tylko przez rodzaj Mucor) polega na hydrolizie skrobi do glukozy, maltozy oraz dekstryn, czyli znacznie mniejszych cukrów niż skrobia. Jest to bardzo istotny etap produkcji alkoholu, ponieważ wydajność fermentacji ze skrobi jest znikoma w porównaniu z fermentacją ze scukrzonej skrobi (drożdże zazwyczaj nie są zdolne do hydrolizy skrobi). Scukrzanie może być przeprowadzone albo przez enzymy amylolityczne pochodzenia roślinnego (m.in. α-amylazy i β-amylazy ze słodu), albo przez enzymy amylolityczne pochodzące z mikroorganizmów.
W praktyce na masę o podwyższonej temperaturze zawierającą uwolnioną skrobię posiewa się zarodniki pleśni, np. Mucor delamar i intensywnie napowietrza zacier. Rosnące grzyby wydzielają enzymy amylolityczne, które scukrzają skrobię. Następnie schładza się zacier i dodaje drożdży. Zaletą stosowania pleśni zamiast słodu jest wyższa wydajność scukrzania skrobi, więc również wyższa wydajność produkcji alkoholu, jednak cały proces trwa znacznie dłużej i wymaga napowietrzania, co zwiększa koszty produkcji.
Dojrzewanie serów
Podczas produkcji sera zwykle stosuje się podpuszczkę (inaczej chymozynę) zwierzęcą jako czynnik ścinający mleko. Pozyskuje się ją z żołądków zabitych cieląt. Alternatywą dla wegetarian jest produkcja sera z wykorzystaniem enzymów ścinających mleko, które pochodzą z mikroorganizmów, np. Mucor miehei. Z tzw. „podpuszczki mikrobiologicznej” korzysta większość światowych i krajowych producentów serów. Europejski Urząd do spraw Bezpieczeństwa Żywności jeszcze nie przyznał rodzajowi Mucor certyfikatu Qualified Presumption of Safety (QPS), czyli nie jest pewne, czy jest bezpieczny dla człowieka (ale też nie stwierdzono, że jest niebezpieczny).
Smak serów, przy produkcji których wykorzystano „podpuszczkę mikrobiologiczną”, jest bardziej gorzki niż serów produkowanych z użyciem podpuszczki zwierzęcej, szczególnie przy dłuższych okresach dojrzewania.
Produkcja enzymów
Pleśnie rodzaju Mucor są producentami enzymów proteolitycznych, amylolitycznych oraz lipaz na skalę przemysłową.
Wykorzystywane w produkcji proteaz gatunki to m.in. Mucor circinelloides, Mucor genevensis, Mucor hiemalis, Mucor piriformis i Mucor variosporus. Spośród proteaz na największą skalę przez te pleśnie jest produkowana kwaśna proteaza.
O produkcji enzymów amylolitycznych wspomniano już w części poświęconej scukrzaniu skrobii. Gatunkami produkującymi enzymy amylolityczne (α-amylaza, glukoamylaza) na skalę przemysłową są Mucor rouxii i Mucor javanicus.
Do produkcji lipaz o handlowej nazwie Palatase stosuję się gatunek Mucor miehei. Natomiast lipazy pozyskane z Mucor circinelloides oraz Mucor racemosus są wykorzystywane m.in. w procesie bioremediacji gleb skażonych produktami ropy naftowej.
Produkcja związków lipidowych
Wśród związków lipidowych głównymi produktami są kwasy tłuszczowe, w tym nienasycony kwas γ-linoleinowy. Do produkcji wykorzystuje się np. gatunki Mucor javanicus, Mucor favanieus czy Mucor rouxii.
Przemysł farmaceutyczny
Gatunek Mucor miehei jest wykorzystywany w produkcji reniny, czyli angiotensynazy, enzymu zaangażowanego w układ hormonalno-enzymatyczny, w skład którego wchodzą renina, angiotensyna i aldosteron. Układ ten odpowiada za objętość krążącej w ciele krwi i stężenie jonów sodowych i potasowych w płynach ustrojowych.
Zagrożenia
Pleśnie z rodzaju Mucor stanowią niekiedy zagrożenie produkcji przemysłowej. Dzieje się tak np. w mleczarniach, gdzie przez powietrze zanieczyszczone zarodnikami mogą one zakazić masło i przez swoją aktywność lipolityczną częściowo rozłożyć jedo składniki. Pleśnie te mogą również utworzyć na powierzchni sera niepożądane czarne lub brunatne kolonie.
Bibliografia
- Amylase Production by Mucor miehei and M. pusillus, P. R. Adams, J. J. Deploey, Mycologia, Vol. 68, No. 4, 934-938
- Screening of Mucor spp. for the production of amylase, lipase, polygalacturonase and protease, Maria Helena Alves, Galba M. Campos-Takaki, Ana Lúcia Figueiredo Porto, Adauto Ivo Milanez, Brazilian Journal of Microbiology, 33, 325-330
- Enzyme and microbial systems involved in starch processing, Poonam Nigam, Dalel Singh, Enzyme and Microbial Technology, Vol. 17, Is. 9, 770-778
