====== Rhizomucor ====== Są to strzępkowe grzyby należące do **Sprzężniaków** (//Zygomycetes//), występujące w glebie, oraz na gnijących owocach i warzywach. Spontanicznie zdarzają się też przypadki zakażeń u człowieka wywołanych przez grzyby z tego rodzaju. Grzyby z rodzaju //Rhizomucor// są termofilami (oprócz //Rhizomucor variabilis//) i są w stanie rosnąć nawet w temperaturze 54°C == Temperatura wzrostu - dla Rhizomucor pusillus: == * minimum 20-27°C * optimum 35-55°C * maximum 55-60°C == Do rodzaju Rhizomucor zaliczamy 3 główne gatunki: == * //Rhizomucor pusillus// * //Rhizomucor miehei// * //Rhizomucor variabilis// ==== 1/Klasyfikacja taksonomiczna ==== Królestwo: Grzyby (//Fungi//) Typ: Sprzężniaki (//Zygomycetes//) Klasa: Pleśniakowce (//Mucorales//) Rodzina: Pleśniakowate (//Mucoraceae//) Rodzaj: //Rhizomucor// ==== 2/Patogenność i objawy klinicze: ==== Grzyby z rodzaju //Rhizomucor// wywołują **zygomykozę** (wcześniej zaliczaną do mukormykoz) - oportunistyczną grzybicę zwykle występującą u osób z obniżoną odpornością (przewlekle chorych - np. w białaczce, AIDS, lub po immunosupresji). Zygomykoza zwykle atakuje jamę nosowo-gardłową, płuca, układ trawienny i skórę, rzadziej inne organy. Czasem też dochodzi do zakażenia mózgowo-rdzeniowego, które prowadzi do śmierci w ciągu kilku dni. {{grupa22:zygo3.gif|}} Wycięcie podskórnej zygomykozy {{grupa22:zygo1.gif|}} Zygomykoza mózgowo rdzeniowa, z widocznym zakażeniem podniebienia W przypadku nieleczonej zygomykozy może dojść do **ogólnoustrojowej infekcji** - jest to spowodowane faktem, iż grzyby //Rhizomucor// preferencyjnie atakują układ krwionośny co prowadzi do nekrozy tkanek i organów, która zwykle kończy się śmiercią. Zagrażające życiu grzybice układowe rozwijają się u 20–30% pacjentów z ostrą białaczką, u 10–15% pacjentów z chłoniakami i u 5% pacjentów z nowotworami litymi. O ile zygomykozy u człowieka występują stosunkowo rzadko, to u bydła są bardzo pospolite i są częstym powodem poronień. ==== 3/Charakterystyka makroskopowa: ==== Kolonie //Rhizomucor// rosną na szalkach bardzo szybko (wypełniają szalkę już po 4 dniach). Grzybnia ma postać watowatą, o kolorze na początku białym, który później szarzeje i następnie zmienia się w żółto-brązowy. ==== 4/Charakterystyka mikroskopowa: ==== Nierozdzielona, lub bardzo rzadko rozdzielona grzybnia, szczątkowe ryzoidy (patrz rys 1.2) wyrastające pomiędzy strzępkami zarodnionośnymi (sporangioforami) - patrz rys.1.3, rys 1.4 uwidocznione zarodnie (Sporangia). Sporangiofory są nieregularnie porozgałęziane, mają szkliste i gładkie komórki zakończone zarodniami. Zarodnie mają 40-60 μm średnicy, są brązowe, okrągłe, i umieszczone na trzonkach (Columellach) mających 20-30 μm średnicy i kształt okrągły lub gruszkowaty. Zygospory jeśli są obecne, to są formowane w obrębie grzybni powierzchniowej, mają 45-65 μm średnicy, grube ścianki i kolor od brązowo-czerwonego do czarnego, {{grupa22:1.2_rhizomucor_pusillus_-_primitive_rhizoids.jpg|}} Rys 1.2 - Prymitywne ryzoidy (//Rhizomucor pusillus//) {{grupa22:1.3_rhizomucor_pusillus_-_char_micro.jpg|}} Rys 1.3 - Budowa makro i mikroskopowa (//Rhizomucor pusillus//) {{grupa22:1.4_rhizomucor_pusillus_-_sporangiophores.jpg|}} Rys 1.4 - Zarodnie (Sporangia) u //Rhiozmucor pusillus// ==== 5/Wykorzystanie przemysłowe: ==== === Rhizomucor miehei : === - Produkcja podpuszczki(chymozyny) trawiącej kazeinę. Kazeina po strawieniu rozpada sie na dwa fragmenty - jeden jest rozpuszczalny, a drugi nie i wytrąca się on w postaci twarogu. Dlatego właśnie podpuszczka wykorzystywana jest głównie w przemyśle mleczarskim (do produkcji serów podpuszczkowych - np. Mozarella, Emmentaler). - podpuszczka była tradycyjnie uzyskiwana ze śluzówki czwartej komory żołądka cielęcego - podpuszczki używa się do wytrącania tzw skrzepu słodkiego (wytrącony bez zmiany pH mleka). - jest ona znacznie tańsza od podpuszczki uzyskiwanej z zołądka cielęcego, jednakże sery produkowane rzy jej pomocy są nieco bardziej gorzkawe. Z tego też powodu aktualnie większość podpuszczki używanej w przemyśle spożywczym uzyskuje się z drożdży modyfikowanych genetycznie - posiadają one geny kodujące chymozynę cielęcą. - taka podpuszczka jest koszerna i akceptowana przez wegetarian - w przeciwieństwie do podpuszczki izolowanej z śluzówki żołądka cielęcego. - Produkcja rekombinowanej **lipazy** trójglicerydów aktywnie hydrolizującej tłuszcze i wykazującej enencjospecyficzność przy cięciu - preferuje ciąć wiązania alfa-estrowe, co pozwala uzyskiwać produkty czyste optycznie. Jest ona używana do: • Do produkcji diacylogliceroli (DAG - używane w przemyśle spożywczym, kosmetycznym i medycznym) • Do produkcji biopaliwa - **Biodiesel** (z oleju roślinnego i pierwszorzędowych, niskocząsteczkowych alkoholi o 1-4 atomach węgla (alkoholiza). Zwykle wykorzystuje się lipazę w formie immobilizowanej. Zwykle tą reakcję produkcji biodiesla prowadzi się w temperaturze 45°C, bez jakiegokolwiek dodatku wody, oraz z metanolem i olejem roslinnym w stosunku 6:1. • Do transestryfikacji kwasów tłuszczowych - często używa się tej lipazy w formie immobilizowanej. === Rhizomucor pusillus : === - Produkcja **Fitazy**: **Fitaza** jest enzymem rozkładającym fityny - substancje obficie występujące w paszach roślinnych. Fityny to połączenia organiczne kwasu fosforowego i alkoholu - inozytolu. Kwas fitynowy występuje głównie w postaci soli wapniowo-magnezowych, ale w jego strukturze znajdują się także inne pierwiastki, takie jak żelazo, cynk, itp. Fityniany potencjalnie bardzo bogatym źródłem mikroelementów - głównie **fosforu**, ale także Mg, Zn, Cu, Ca, Fe dla bydła i trzody chlewnej, jednakże z powodu faktu, iż są trudno rozpuszczalnymi związkami, są dla tych zwierząt hodowlanych w większości niestrawne. Dodatek fitazy zwiększa dostępność tych mikroelementów zmniejszając konieczność suplementowania pasz fosforem pochodzenia mineralnego - co w efekcie powoduje wzrost jakości mięsa i zmniejszenie ilości fosforu w odchodach (zmniejszenie zanieczyszczenia wód powierzchniowych). - Produkcja **amylaz** - rozkładających skrobię do sacharozy/dekstrozy. - Uzyskiwanie amylazy na skalę przemysłową - Rhizomucor pusillus hodule się w bioreaktorach, w hodowlach okresowych. Jako pożywkę stosuje się mieszaninę Ekstraktu drożdżowego i skrobi (która stymuluje produkcję amylaz). Proces prowadzi się zwykle w 45°C przez ok 5 dni. Następnie mieszaninę pohodowlaną oczyszcza sie z grzybni, oczyszcza sie z niego α-amylazę, następnie jej roztwór zagęszcza sie przy pomocy ultrafiltracji i otrzymaną amylazę oczyszcza się ponownie, tym razem przy pomocy wysoko wydajnej chromatografii cieczowej lub chromatografii powinowactwa z wykorzystaniem kolumny ze złożem dekstranowym. Dodatkowo, jeśli chce się otrzymać amylazę o bardzo wysokiej czystości, przeprowadza się jeszcze oczyszczanie przy pomocy rozdziału na żelu poliakrylamidowym - otrzymujemy w ten sposób jeden wyraźny prążek w którym znajduje się nasza α-amylaza. === Bibliografia === http://www.doctorfungus.org/Thefungi/rhizomucor.htm http://prod.hopkins-abxguide.org/pathogens/fungi/rhizomucor.html?contentInstanceId=323930 http://www.mycology.adelaide.edu.au/Fungal_Descriptions/Zygomycetes/Rhizomucor/ http://www.uwm.edu.pl/mikologia/galeria2/galeria21.html http://www.biology.ed.ac.uk/research/groups/jdeacon/microbes/thermo.htm Nevena Ogjanovi, Dejan Bezbradnica and Zorica Kneźević, Optimization of the production of biodiesel by a commercial immobilized lipase in a solvent-free system using a response surface methodology, J. Serb. Chem. Soc. 73 (2) 147–156 (2008) Salis et al., 2005 Andrea Salis, Marcella Pinna, Maura Monduzzi and Vincenzo Solinas, Biodiesel production from triolein and short chain alcohols through biocatalysis, Journal of Biotechnology Vol 119, Issue 3 (2005), pp. 291-299. Prof.dr.hab. Tadeusz Barowicz, Fitaza-niezbędny enzyme, Wiadomości Rolnicze Polska, 10 (2007), pp.18 ====== Fermentacja masłowa w przemyśle ====== Fermentacja to rodzaj procesu wytwarzającego ATP, w którym związki organiczne działają zarówno jako donory i akceptory elektronów. Fermentacja może zachodzić przy braku O2 a została odkryta przez Pasteura, który ją opisał jako //„la vie sans l’air” („życie bez powietrza”)//. Fermentacja masłowa prowadzona jest przez bakterie masłowe i zachodzi (schematycznie) zgodnie z równaniem: {{grupa22:schemat_1.jpg|}} Charakterystyczną cechą fermentacji masłowej jest wytwarzanie dużej ilości wodoru, oraz liczne reakcje kondensacji, uwodnienia, wtórnego uwodorowania itd.. W wyniku fermentacji powstają: kwas masłowy, bursztynowy, octowy oraz etanol i duże ilości gazów (CO2 i H2). Bardziej szczegółowo proces ten przedstawiono na przykładzie szlaku prowadzonego przez //Clostridium butyricum//: {{grupa22:schemat_2.jpg|}} ===== Bakterie prowadzące fermentację masłową: ===== Fermentację masłową prowadzą bezwzględnie beztlenowe, przetrwalnikujące, gramdodatnie laseczki: * //Clostridium butyricum// * //Clostridium pasteurianum// * //Clostridium tyrobutyricum// * //Clostridium pectinovorum// {{grupa22:zdjecie_1.jpg|}} oraz: * //Butyrivibrio fibrisolvens// * //Eubacterium limosum// * //Bacteroides melaninogenicus// * //Treponema phagedenis// {{grupa22:zdjecie_2.jpg|}} a także niektóre szczepy rodzajów: * //Sarcina// * //Butyribacterium// * //Fusobacterium// * //Megasphera// ===== Źródła kwasu masłowego dla przemysłu: ===== Kwas masłowy można otrzymać na drodze utleniania aldehydu masłowego otrzymywanego z propylenu poprzez oksosyntezę. Taki kwas masłowy nie jest jednak stosowany w przemyśle spożywczym, gdyż konsumenci są sceptycznie nastawienie do związków syntetycznych, wolą gdy do żywności dodawane są jedynie składniki naturalne, np. kwas masłowy ekstrahowany z masła. Kwas masłowy ekstrahowany z masła jest jednak drogi a jego oczyszczanie problematyczne, dlatego poszukuje się jego innych, tanich źródeł nie budzących sprzeciwu konsumentów. Tanią i dobrze znaną metodą produkcji kwasu masłowego jest właśnie **fermentacja masłowa**, prowadzona przez bakterie, zwłaszcza z rodzaju //Clostridium//, //Butyrivibrio// i //Butyribacterium.// ===== Charakterystyka bakterii masłowych na przykładzie klostridiów: ===== ==== Informacje ogólne: ==== Najważniejszą grupą mikroorganizmów produkujących kwas masłowy są bakterie z rodzaju Clostridium należące do rodziny Bacillaceae. Bakterie te są gramdodatnie, chemoorganotroficzne, perytrychalnie urzęsione i cechują się wielką ruchliwością. Komórki wegetatywne mają kształt laseczek, ale często ulega on modyfikującemu wpływowi środowiska. Endospory są owalne bądź kuliste, a ponieważ ich średnica zazwyczaj przewyższa średnicę komórki wegetatywnej, komórka ulega deformacji i przyjmuje kształt maczugowaty. Endospory klostridiów są oporne na ciepło. Pod względem fizjologicznym, klostridia charakteryzują się intensywnym metabolizmem fermentacyjnym oraz wyróżniają się stosunkiem do tlenu, niektóre są bezwzględnymi beztlenowcami, inne go niemal tolerują. Klostridia gromadzą materiały zapasowe w postaci wielocukrów podobnych do skrobi. ==== Substraty energetyczne wykorzystywane przez klostridia: ==== Klostridia mają szerokie spektrum substancji które mogą fermentować. Niektóre gatunki mogą wykorzystywać bardzo wiele różnych substratów w zależności od ich dostępności w otoczeniu, podczas gdy inne są wysoce wyspecjalizowane i korzystają tylko z niektórych. Łącznie klostridia metabolizują: * Wielocukry: skrobię, glikogen, celulozę, hemicelulozę, i pektyny * Kwasy nukleinowe * Białka * Aminokwasy * Puryny i Pirymidyny Niektóre klostridia wymagają do wzrostu złożonych podłóż o nietypowym składzie, inne rosną dobrze na prostych pożywkach. Część gatunków z rzędu //Clostridium// wykorzystuje jako jedyne źródło azotu azot cząsteczkowy wiążąc go z duża szybkością (np. //Clostridium pasteurianum//), inne nie. ==== Wzbogacanie i izolacja bakterii: ==== Wygodny sposób otrzymywania hodowli wzbogacających klostridiów stwarza nam fakt ciepłooporności ich endospor. Stosujemy pasteryzowane inokulum i zapewniamy beztlenowe warunki wzrostu, co wyklucza dodatkowo wszystkie organizmy tlenowe. Sacharolityczne klostridia adsorbują na powierzchni wielocukrów takich jak skrobia czy celuloza, dlatego dysponując dobrym źródłem tych bakterii takim jak np. treść żwacza przeżuwaczy, można przemyć takie ziarna, inne bakterie zostaną odpłukane, a większość klostridiów nadal będzie przyczepiona. Innymi źródłami tych bakterii są gleba i ścieki. ==== Przechowywanie: ==== Długotrwałe przechowywanie klostridiów możliwe jest po liofilizacji, krótkotrwałe natomiast prowadzi się w pożywce minimalnej lub wprost w sterylnej wodzie w temperaturze 4 °C. Klostridia można również zawiesić w roztworze glicerolu i zamrozić w – 70 °C. ==== Hodowla: ==== Optymalne warunki dla życia klostridiów to temp. 35-37 °C i atmosfera czystego CO2, N2 lub mieszanina tych gazów w stosunku 9:1. pH powinno mieścić się w zakresie 4,5 – 7,0 a jego wybór zależy od ukierunkowania produkcji. Produkcja kwasu masłowego dominuje w pH w górnym zakresie normy, w niższych pH coraz bardziej wzrasta produkcja butanolu. Głównymi produktami fermentacji masłowej są zatem kwas **masłowy i butanol**. Produkty uboczne to: **kwas octowy, aceton, kwas mlekowy, etanol**. Fermentacja masłowa daje 3 mole ATP, podczas gdy octowa 4 mole. Dlatego też, w szybko rosnących hodowlach dochodzi do wzrostu produkcji kwasu octowego, który świadczy o tym, iż bakterie próbując pokryć swe wymagania energetyczne preferencyjnie utleniają glukozę do octanu. ==== Optymalizacja hodowli: ==== Fermentację masłową prowadzi się najczęściej w bioreaktorach z okresowym zasilaniem w pożywkę. W metodzie tej, mikroorganizmy bytują w pożywce limitowanej jakimś składnikiem pokarmowym, najczęściej glukozą. Gdy do bioreaktora dodamy wysokoskoncentrowany syrop glukozowy, uzyskamy gwałtowny wzrost biomasy. Strategia taka pozwala ograniczyć produkcję związków ubocznych, a co za tym idzie uzyskujemy czystszy kwas masłowy. Zupełnie produktów ubocznych uniknąć się nie da. Aby zminimalizować ich stężenie, możemy stosować kultury bakteryjne z częściową recyklizacją biomasy. Dodatkowo produkcja kwasu masłowego stymulowana jest przez limitację w pożywce azotu i fosforu. Aż 50 % wzrost jego produkcji można też uzyskać dodając do pożywki biotynę. W trakcie fermentacji masłowej niezwykle ważna jest kontrola pH kultury. Ważna jest także aktywność enzymów działających w ciągu przemian od acetylo-CoA do butyrylo-CoA. Aktywność ta musi być duża jeśli chcemy otrzymać zadowalający poziom produkcji, a decyduje o niej wewnątrzkomórkowe stężenie ATP i stosunek stężenia NADH:NAD. Stężenia te możemy pośrednio modulować zmieniając warunki oksydoredukcyjne w komórce za pomocą wiologenu metylu. Bezpośrednio na enzymy możemy wpływać rifampicyną i chloramfenikolem, czy też limitacją stężenia jonów żelaza. Chociaż hodowle okresowe z zasialaniem dają względnie mało produktów ubocznych, to nie są zbyt produktywne. Zdecydowanie bardziej produktywne są hodowle ciągłe ze stałym dopływem substancji odżywczych. Ich wadą jest jednak mała zawartość kwasu masłowego w otrzymanej biomasie. Pewnym ulepszeniem tej techniki pozwalającym zwiększyć produkcje maślanu jest metoda recyklizacji części biomasy z powrotem do bioreaktora. Kluczem do optymalizacji produkcji kwasu masłowego jest znalezienie złotego środka między wolnym tempem wzrostu gwarantującym czystość produktu, a dużą produktywnością zwiększającą opłacalność procesu. Aby zapewnić optymalne warunki hodowli, należy stale kontrolować przynajmniej jeden parametr który daje nam pojęcie o stanie hodowli. Parametrem z wyboru jest tu najczęściej ilość wytwarzanego w trakcie fermentacji gazu. Inna metoda produkcji kwasu masłowego na drodze fermentacji wykorzystuje w tym celu bakterie immobilizowane za pomocą alkoholu poliwinylowego i kwasu borowego. Kolejna technologia produkcji kwasu masłowego składa się z dwóch faz. W pierwszej bakterie mlekowe, np. //Lactobacillus bulgaricus// fermentują węglowodany w kwas mlekowy który następnie strąca się w nierozpuszczalnej soli. Sól taką izolujemy i rozpuszczamy w nowej pożywce. W nowej pożywce uwalniamy kwas z soli i przekształcamy go w inny kwas organiczny za pomocą wybranego szczepu. Choć zależy nam na osiągnięciu jak najwyższej produkcji, to trzeba wiedzieć, że wzrost stężenia kwasu masłowego w trakcie fermentacji, na drodze ujemnego sprzężenia zwrotnego, hamuje swoją własną syntezę. Jest to proces tyleż szkodliwy, co normalny i często obserwowany w biochemii. Sposobem na jego rozwiązanie jest usuwanie powstającego kwasu in situ w trakcie produkcji. Dokonuje się tego na drodze elektrodyfuzji i ekstrakcji za pomocą wyrafinowanej metody trójfazowej. Pierwszą fazą jest tu pożywka, drugą faza organiczna, np. mieszanina Alamine 336 lub Hostarex 327 z alkoholem oleinowym która staje się swego rodzaju płynną membraną przez którą przechodzi ekstrahowany związek do trzeciej fazy którą stanowi następna faza wodna. Przykładowy bioreaktor fermentacyjny: {{grupa22:bireaktor1.jpg|}} ===== Rola fermentacji masłowej i kwasu masłowego w przemyśle: ===== * Kwas masłowy stosowany jest w przemyśle od początków XX w. Już w 1923 r. opisano jego wykorzystanie w produkcji paliw. * W dzisiejszych czasach kwas masłowy używany jest powszechnie w przemyśle spożywczym i alkoholowym. W czystej formie stosowany jest czasem w serowarstwie, a w formie estrów służy wzmacnianiu zapachu owoców. * Inną gałęzią gospodarki w której wykorzystuje się kwas masłowy jest przemysł chemiczny i farmaceutyczny. * Kwas masłowy w formie czystej czy też pochodnych znalazł również zastosowanie w przemyśle tworzyw sztucznych, zwłaszcza włókien syntetycznych. * Gatunki pektynolityczne z rodzaju //Clostridium// rozluźniają tkanki roślinne co pozwala na oddzielenie włókien celulozowych. Proces ten jest wykorzystywany w przemyśle włókienniczym w trakcie obróbki lnu, konopi i innych roślin zawierających włókna łykowe. * Obecnie intensywnie bada się możliwości produkcji etanolu jako ubocznego produktu fermentacji masłowej, który wykorzystywany jest później jako paliwo. Metoda ta ma swoje uzasadnienie w tym, że bakterie masłowe a zwłaszcza klostridia, mają bardzo szerokie spektrum substratów pokarmowych co pozwala uzyskać cenny etanol niejednokrotnie z materiałów odpadowych. * Fermentacja masłowa ma również negatywny wpływ na niektóre technologie produkcyjne. Z racji, że klostridia tworzą spory trudne do zabicia w procesach technologicznych, dlatego też mogą mieć negatywny wpływ na produkcję żywności. * Przetrwalniki klostridiów mogą występować w przetworach mięsnych, warzywnych czy serach. Przetrwalniki te mogą powodować następnie psucie się żywności, gnicie ziemniaków, bombaż niesterylnych konserw mięsnych, warzywnych, czy mleka skondensowanego a także wzdęcia serów. Kwas masłowy ma odrażający smak i zapach, dlatego też już niewielkie jego ilości dyskwalifikują żywność jako zdatną do spożycia. * Nie bez znaczenia są też straty wywołane infekcjami klostridiami kiszonek i innych pasz rolniczych. Skarmienie zwierząt kiszonką zainfekowaną bakteriami masłowymi może wywołać ich zatrucie lub zakażenie mleka, które później nie nadaje się do przetwórstwa. ==== Bibliografia: ==== Zinder,S. 1984. Microbiology of anareobic conversion of organic wastes to methane: Recent developments. Am. Soc. Microbiol. News 50:294-298. Stryer, L. Biochemia. Wydawnictwo naukowe PWN. Warszawa 2003. Schlegel, H.G. Mikrobiologia ogólna. Wydawnictwo naukowe PWN. Warszawa 2004. Zigová, J; Sturdík, E. 2000. Advances in biotechnological production of butyric acid. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology. Volume: 24, pp. 153 - 160. Libudzisz, Z.; Kowal, K. [red.], [aut. Chmiel, A. et al.]; Mikrobiologia techniczna T 2, Politechnika Łódzka. Łódź 2000. Michael T. Madigan, John M. Martinko, Jack Parker.[red.]. Brock biology of microorganisms. Upper Saddle River : Prentice-Hall Inc., 1997. http://plant.geoman.ru/books/item/f00/s00/z0000000/pic/st002_47.jpg http://plant.geoman.ru/books/item/f00/s00/z0000000/pic/st012_78.jpg http://microbiology.scu.edu.tw/micro/bacteria/picture/B114.jpg http://www.zuova.cz/informace/pic/nrlpab23_euli.jpg http://www.egr.msu.edu/pel/pictures/BBIbioreactor.jpg