Neurospora jest grzybem należącym do workowców. Rośnie w klimacie tropikalnym, subtropikalnym i umiarkowanym. Spotykamy go między innymi w glebie, łajnie i gnijącej materii roślinnej. Neurospora znany jest ze swych zdolność do porastania zniszczonych pożarami obszarów leśnych, pomaga w ten sposób rozłożyć spalone organizmy. Charakteryzuje się szybką reprodukcją, łatwą uprawą oraz zdolnością do przetrwania na minimalnym medium.
Obejmuje takie gatunki jak:

• N. crassa,
• N. intermedia,
• N. sitophila,
• N. tetrasperma.

rys. Neurospora crassa

N. crassa, wykorzystywany w biologii jako organizm modelowy, jest najbardziej znany z pośród wyżej wymienionych gatunków. Jest to występująca powszechnie na chlebie różowa pleśń.
Edward Lawrie Tatum i George Wells Beadle wykorzystali promieniowanie-X do mutagenezy N. crassa i wykazali, że uzyskane w ten sposób mutacje powodowały zmiany w funkcjonowaniu enzymów zaangażowanych w metabolizm. Na podstawie tych badań sformułowali hipotezę „jeden gen = jeden enzym”.
Schemat przeprowadzonego doświadczenia przedstawia rysunek poniżej:

W 2003 poznano cały genom tego organizmu. Ma on ok. 43 miliony par zasad i zawiera ok. 10000 genów na 7 chromosomach. Obecnie realizowany jest projekt badający efekty uszkodzenia po kolei każdego genu tego organizmu.
Struktura komórek Neurospory ma wiele cech wspólnych z innymi organizmami eukariotycznymi. Cytoplazma jest otoczona błoną cytoplazmatyczną, a ściany komórkowe są zazwyczaj zbudowane z chityny. Istnieje co najmniej dwanaście wyspecjalizowanych typów komórek. Trzy najpowszechniejsze to:

• komórki strzępkowe,
• konidia,
• askospory.

Ściany komórek strzępkowych są sztywne, z wyjątkiem koniuszków, gdzie następuje wzrost. Askospory są haploidalnymi zarodnikami, powstającymi w workach. Są one bardziej odporne na stres niż konidia. Konidia są haploidalnymi sporami bezpłciowymi. Sposób wzrostu Neurospora zależy od rodzaju organizmu. Drożdże rosną poprzez podział komórki, podczas gdy grzyby strzępkowe rosną na długość poprzez części szczytowe strzępek. Neurospora są jednymi z najszybciej rosnących grzybów strzępkowych (ok. 10 cm na dzień). Ponieważ Neurospora należy do Ascomycota, rozmnaża się płciowo i bezpłciowo. Organizmy należące do Neurospora większość swojego życia są haploidalne, co jest bardzo ważną dla badaczy cechą, gdyż ułatwia identyfikację zmutowanego genu, nie jest on bowiem maskowany przez normalny (niezmutowany) allel występujący w chromosomie homologicznym. Neurospora wytwarza konidia (haploidalny spory bezpłciowe), które rosną i tworzą w wyniku podziałów mitotycznych większą liczbę komórek haploidalnych. W wyniku fuzji (koniugacji) dwóch takich komórek powstaje zygota, jest to krótkotrwała faza płciowa cyklu życiowego grzyba. Zygota przechodzi cykl podziałów mejotycznych w wyniku których powstają haploidalne spory płciowe. Uczeni mogą zatem krzyżować płciowe formy mutantów grzyba w celu przeprowadzenia ich analizy genetycznej. U Neurospora wyróżniamy trzy różne płciowe cykle życiowe:

• heterotalliczny,
• homotalliczny,
• pseudohomotalliczny.

Poniższy rysunek przedstawia schemat cyklu heterotallicznego:

W heterotallicznym cyklu życiowym (N. crassa) dwie komórki o przeciwnych typach płciowych: A i a, determinowane są przez zmienne sekwencje DNA na chromosomalnym locus. nazywane Mat- A i Mat- a zlewają się ze sobą, w rezultacie powstaje diploidalna komórka. Mejoza daje cztery haploidalne komórki. Komórki te przechodzą mitozę wewnątrz woreczka i formują osiem spor.

W homotallicznym cyklu życiowym (N. galapagoensis) nie występują różne typy płciowe grzybni tak jak to jest w przypadku cyklu hererotallicznego. Dochodzi tu do utworzenia par jąder sprzężonych, a następnie w komórkach do faktycznego zlania się jąder haploidalnych i wytworzenia diploidalnego jądra (komórka macierzysta askospor). Dwa podziały mejotyczne tego jądra i następująca po nich mitoza prowadzą do wytworzenia worków, zawierających po 8 askospor. W czasie różnicowania askospor dochodzi do jeszcze jednego podziału mitotycznego wewnątrz askospory i dlatego każda askospora zawiera dwa haploidalne jądra identyczne genetycznie. Z askospor wyrasta homokariotyczna grzybnia haploidalna.

W pseudohomotallicznym cyklu życiowym (N. tetrasperma), spory wyrastają na podwójne typy płciowe. Mogą one przejść cykl płciowy bez łączenia z innymi komórkami. Spory formują mycele, które produkują lotne strzępki i konidia.

Neurospora znalazła zastosowanie w badaniach biochemicznych, genetycznych a także w produkcji przemysłowej różnych enzymów.
N. crassa produkuje:

• enzymy oksydatywne wykorzystywane w biodegradacji związków fenolowych,
• zewnątrzkomórkowe kompleksy celulazowe,
• zewnątrzkomórkową ksylanazę.

N. crassa wykazuje zdolność bezpośredniego fermentowania celulozy do etanolu.

Poniższa tabela przedstawia produkcję ksylanazy i celulazy z różnych źródeł węgla.

Jak widać z tabeli, w doświadczeniu zewnątrzkomórkowa aktywność była słaba gdy fermentacja zachodziła z glukozy. Najwyższa produkcja ksylanazy była obserwowana 4 dnia kiedy organizm był hodowany na handlowym ksylanie. Aktywność celulazy była największa kiedy celulozowy proszek był połączony z otrębami przenicy lub ketmią konopiowatą.

Źródła:

1. http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Neurospora
2. www.fgsc.net/Neurospora/sectionB2.htm
3. www.linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0141022901003908

Fermentacja jabłkowo- mlekowa to przemiana kwasu jabłkowego w kwas mlekowy i dwutlenek węgla w winie pod wpływem bakterii kwasu mlekowego z rodzaju Leuconostoc, Pediococcus i Lactobacillus.

Bakterie kwasu mlekowego należą do gram-pozytywnych organizmów. Mają istotne znaczenie w produkcji sfermentowanego jedzenia oraz napojów. Bakterie te przekształcając kwas jabłkowy w kwas mlekowy. Wykazują one charakter homo- bądź heterofermentacyjny. Bakterie homofermentacyjne produkują z glukozy kwas mlekowy i dwutlenek węgla. Heterofermentacyjne, natomiast dodatkowo etanol i kwas octowy. Wśród ziarenkowców bakterie z rodzaju Pediococcus są homofermentacyjne, a te z rodzaju Leuconostoc heterofermentacyjne. Pałeczki kwasu mlekowego można podzielić na trzy grupy: homofermentacyjne, heterofermentacyjne fakultatywne i heterofermentacyjne obligatoryjne Bakterie z pierwszej grupy nie fermentują pentoz i rozkładają cząsteczkę glukozy na dwie cząsteczki kw. mlekowego. Heterofermentacyjne fakultatywne rozkładają cząsteczkę glukozy na dwie cząsteczki kw. mlekowego, ale również pentozy na kw. mlekowy i octowy. Heterofermentacyjne obligatoryjne rozkładają glukozę na dwutlenek węgla, kw. mlekowy, octowy i etanol.

Fermentacja jabłkowo - mlekowa znajduje zastosowanie w produkcji win, gdyż zmienia ich charakter organoleptyczny, stają się one mniej kwaśne, bardziej zharmonizowane, aksamitne, o bardziej złożonym zapachu. Do substancji zmieniających smak i towarzyszących fermentacji jałkowo-mlekowej należą m.in:

• kwas octowy ( ma cierpki smak, zapach niezbyt intensywny)
• diacetyl ( ma charakterystyczną maślaną nutę)
• acetoin
• 2,3 butanediol (ma łagodny aromat, lekko gorzkawy smak
• mleczan etylu (daje owocowy charakter)
• bursztynian dietylu (daje owocowy charakter)
• akroleina ( daje w połączeniu z fenolowymi związkami mocno gorzkawy smak)

Jeśli fermentacja jabłkowo-mlekowa zachodzi w beczce, bądź w kontakcie z drewnem dębowym, aromaty pochodzące z drewna stapiają się z zapachami I -wszo i II-go rzędowymi nie maskują ich, co zdarza się często, jeśli wino przelewane jest do dojrzewania w beczkach już po jej zakończeniu.

Obserwuje się wyraźny wzrost kwasowości lotnej na koniec fermentacji, kiedy już nie ma kwasu jabłkowego i bakterie zaczynają żywić się pozostałym w winie cukrem. Dlatego niezwykle istotne jest kontrolowanie końca fermentacji i natychmiastowe zatrzymanie dalszej fermentacji (np. pirosiarczynem) po stwierdzeniu, ze w winie nie ma już kwasu jabłkowego.

Fermentacja jabłkowo-mlekowa oprócz odkwaszenia i zmiany smaku wina, powoduje również stabilizację bakteryjną. Oznacza to zahamowanie wzrostu innych niż baterie mlekowe organizmów. Bakterie kwasu mlekowego pobierają składniki odżywcze, które w przeciwnym razie byłyby wykorzystywane przez inne organizmy. Bakterie te produkują również toksyny (bakteriocyny), które hamują wzrost innych bakterii.

Fermentacja jabłkowo-mlekowa stosowana jest głownie w winach czerwonych, przeznaczonych do długiego dojrzewania, a także w wybranych białych winach, takich jak Chardonnay, Pinot Blanc, Pinot Gris.

Fermentacja jabłkowo-mlekowa zachodzi gdy:

• pH znajduje się pomiędzy 4,2 a 4,5, poniżej pH= 3,3 fermentacja jabłkowo-mlekowa staje się bardzo trudna; kiedy pH jest zbyt niskie, możemy ułatwić rozpoczęcie fermentacji przez lekkie odkwaszenie wina
• temperatura wynosi 30°C; przy 10-14% vol, temperatura optymalna spada do 18- 25°C; praktycznie, najczęściej przeprowadza się ja miedzy 20 a 25°C; bardzo trudno ja wywołać przy temperaturze niższej niż 20°C
• jest niskie stężenie dwutlenku siarki, bakterie są wrażliwe na jego działanie, dlatego przy zlewaniu znad osadu win przeznaczonych do FJM, unika się jego stosowania
• zawartość alkoholu nie jest zbyt wysoka

Źródła:

1. http://old.wino.org.pl/frames/fjm-aga.htm
2. http://www.bcawa.ca/winemaking/ml.htm
3. http://lfbisson.ucdavis.edu/PDF/VEN124%20Section%204.pdf

Napój mleczny, pochodzący z Kaukazu, wytwarzany z pasteryzowanego mleka. Jest produktem mieszanej fermentacji, mlekowej i alkoholowej. Kwas mlekowy jest produkowany przez drobnoustroje podobne do Streptococcus lactis i Lactobacillus bulgaricus, natomiast alkohol - przez fermentujące laktozę grzyby drożdżowe.

Produkcja kefiru

Mleko na kefir (pełne, odtłuszczone lub normowane) poddawane jest pasteryzacji (w temperaturze około 85°C), repasteryzacji (w temperaturze około 95°C), następnie jest schładzane i szczepione zakwasem kefirowym w ilości 1-1,5% (ilość zależy od aktywności zakwasu). Fermentacja mleka przebiega w dwóch etapach. Początkowo w temperaturze około 21°C, później następuje okres dojrzewania w temperaturze poniżej 15°C.

Kefir może być produkowany metodą termostatową lub zbiornikową, przy czym początek procesu jest taki sam w obu metodach (Dzwolak et al., 2000).

• Metoda termostatowa - zaszczepione mleko jest pakowane w opakowania jednostkowe (w których następuje fermentacja) i inkubowane w temperaturze ponad 20°C do osiągnięcia wymaganej kwasowości, a otrzymywany kefir poddawany jest dojrzewaniu w temperaturze około 10°C przez 1 do 3 dni, po czym produkt jest schładzany i pakowany.
• Metoda zbiornikowa - zaszczepienie mleka odbywa się w zbiornikach fermentacyjnych, przy takich samych jak w metodzie termostatowej parametrach. Po wytworzeniu kefiru jest on schładzany do temperatury około 15°C w zbiorniku lub ochładzaczu rurowym, a następnie pakowany w opakowania jednostkowe i poddawany dojrzewaniu w temperaturze około 10°C przez 1 do 3 dni, po czym produkt jest schładzany i pakowany.

Czas dojrzewania kefiru znacząco wpływa na jego kwasowość i zawartość alkoholu, skład kefiru według Bouronoffa (cytowany przez Neukomma), jest następujący:

• 1-dniowy kefir 2,78% laktozy 0,76% kw.mlekowego 0,63% alkoholu
• 2-dniowy kefir 2,24% laktozy 0,83% kw.mlekowego 0,81% alkoholu
• 3-dniowy kefir 1,67% laktozy 0,90kw.mlekowego 1,10% alkoholu

Dobry kefir powinien mieć jednolity, zwarty skrzep, bez odpływu serwatki, z nielicznymi smugami i pęcherzykami gazu (CO2). Smak i zapach przyjemnie kwaskowaty, czysty, z charakterystycznym aromatem. W zależności od „wieku”, kefir wykazuje słabsze lub silniejsze właściwości musowania.

Zakwas kefirowy

Zakwas do produkcji kefiru przygotowuje się z mleka odtłuszczonego, przy użyciu ziaren kefirowych w stanie świeżym lub suszonym.

rys. Ziarna kefirowe

Ziarna kefirowe (grzybki kefirowe) to symbiotyczny układ bakterii paciorkowców mlekowych, bakterii pałeczek mlekowych i drożdży lub w przypadku biokefirów, także bifidobakterii (obecnie coraz częściej, zamiast grzybków, używa się do produkcji kefiru kultur bakteryjnych uzyskując produkt nieco zmieniony w stosunku do tradycyjnego).

Ożywianie suszonych ziaren kefirowych przeprowadza się, zalewając je przez kilka dni przegotowaną, ciepłą (30°C) wodą, zmienianą 2 razy dziennie, do czasu gdy napęczniałe grzybki wypłyną na powierzchnię. Sito używane do odcedzania ziaren należy starannie wyparzać przed każdym użyciem.

Ożywione grzybki, podobnie jak świeże, zalewa się mlekiem spasteryzowanym (85-90°C przez 25 minut), ostudzonym do 25°C. Na 1 litr mleka bierze się 100 g ziaren kefirowych i pozostawia się je w temperaturze 18-20°, aż do ścięcia mleka. Ponieważ grzybki szybko przyrastają, należy co pewien czas odbierać ich nadmiar, tak aby utrzymać stosunek ilości mleka do ciężaru ziaren. Oznaką normalnej, właściwej aktywności ziaren kefirowych jest ich wypływanie na powierzchnię mleka i silny, zwarty skrzep zakwasu występujący po 16-18 godzinach, o czystym, aromatycznym smaku i zapachu.

Po ścięciu mleka, skrzep z grzybkami miesza się za pomocą mątewki. Przecedzony przez sito zakwas służy do zaprawiania mleka przeznaczonego na kefir, a odcedzone na sicie grzybki, po przemyciu wodą, zalewa się nową porcją mleka (spasteryzowanego i schłodzonego) na zakwas, na dzień następny. Przemywaniu ziaren kefirowych należy poświęcić wiele uwagi, gdyż zbyt silnie płukane (silnie odkwaszone) łatwo zakażają się niepożądaną mikroflorą, a niewłaściwie wypłukane mogą nadmiernie się zakwasić, co narusza właściwą równowagę między paciorkowcami a laseczkami w ziarnach kefirowych.

Mikroflora ziaren kefirowych

Według Palladinej mikroflora normalnych ziaren kefirowych składa się z 70% paciorkowców, 25% pałeczek i 5% drożdży.

Bakterie mlekowe powodują w kefirze fermentację mlekową.

Wśród paciorkowców mlekowych występują gatunki:

• kwaszące - Streptococcus lactis, Streptococcus eremom,
• aromatyzujące - Streptococcus diacetilactis czy gatunki z rodzaju Leuconostoc.

Z laseczek mlekowych występuje Lactobacillus caucasicus.

rys. Leuconostoc

Fermentację alkoholową prowadzą drożdże:

• zarówno gatunki zarodnikujące - np. Saccharomyces kefir, mogące bezpośrednio fermentować laktozę,
• jak i niezarodnikujące (tzw. nibydrożdże) - Torula kefir, wykorzystujące laktozę dopiero po jej hydrolizie na cukry proste.

Poza tą zidentyfikowaną mikroflorą grzybków kefirowych, występuje w nich mieszana mikroflora towarzysząca, wśród której stwierdza się obecność bakterii peptonizujących, zdolnych do bezpośredniego atakowania białka. Rolą ich jest prawdopodobnie udostępnienie źródeł azotu pozostałym drobnoustrojom w ziarnach kefirowych.

Substancją utrzymującą strukturę ziarna kefirowego jest polisacharyd (glukozo-galaktan) zwany potocznie kefiranem.

Wady zakwasu i ziaren kefirowych

Błędy popełniane przy prowadzeniu zakwasów mogą prowadzić do zaburzeń w produkcji, często trudnych do zwalczania. Ścisłe przestrzeganie właściwych temperatur hodowli, właściwa pasteryzacja mleka i jak najdalej posunięta czystość zapewniają dobre wyniki przy przygotowywaniu zakwasu i produkcji kefiru.

Najczęściej spotykanymi wadami zakwasu i grzybków kefirowych są:

1. utrata właściwego smaku i zapachu,
2. śluzowatość grzybków,
3. zakażenie bakteriami z grupy coli.

1) Utrata właściwego smaku i aromatu. Wada ta jest powodowana niewłaściwymi temperaturami prowadzenia zakwasu. Zbyt wysokie temperatury (powyżej 25°C) stwarzają lepsze warunki dla bakterii mlekowych, które tłumią rozwój) grzybów drożdżowych. Kefir (staje się wtedy podobny w smaku do zsiadłego mleka, bez właściwości musujących i bez odpowiedniego aromatu. Zbyt niskie temperatury powodują z kolei wadę smaku drożdżowego, przy braku aromatu i zbyt silnym gazowaniu produktu. Stosowanie odpowiednich dla hodowli temperatur może przywrócić właściwą równowagę mikroflory ziaren kefirowych, jeśli dłuższy okres niewłaściwej hodowli nie spowodował w ziarnach zbyt daleko posuniętych zmian w składzie mikroflory. Wówczas należy grzybki kefirowe zmienić.

2) Śluzowatość ziaren kefirowych. Ziarna stają się oślizłe, tracą charakterystyczną sprężystość, na powierzchni ich występuje mączysty nalot. Powodem tej wady jest pospolita w mleczarstwie pleśń Ceotrichum candidum. Grzybki odkwaszone przez rozwijającą się na nich pleśń stają się podatne na działanie bakterii gnilnych. Skutecznym sposobem pozbycia się zakażenia pleśnią jest hodowla zakażonych grzybków w kolbach o wysokich szyjkach, całkowicie napełnianych mlekiem. Przez kilka kolejnych dni górną zakażoną warstwę grzybków zbiera się i odrzuca. Pleśnie jako wybitne tlenowce rozwijają się tylko w górnej warstwie grzybków i w ten sposób dość szybko udaje się je usunąć z ziaren kefirowych.

3) Zakażenie bakteriami z grupy coli. Może być ono spowodowane niewłaściwą pasteryzacją mleka przeznaczonego na zakwas lub przez jakieś zakażenie kontaktowe. Powoduje to niewłaściwą fermentację mlekową, prowadzoną przez te bakterie, a przez to wystąpienie nieczystego smaku i zapachu zakwasu oraz nadmierne jego gazowanie. Dobre wyniki przy zwalczaniu tej wady daje kilkakrotne zalewanie odcedzonych grzybków kefirowych rozbełtanym, dobrym zsiadłym mlekiem, zamiast mlekiem słodkim.

Wady kefiru podobnie jak zakwasu:

• nadmiernie kwaśny smak, brak musowania i aromatu, spowodowane są zbyt wysokimi temperaturami produkcji,
• nadmierne musowanie i smak drożdżowy spowodowane są zbyt niskimi temperaturami,
• nieczysty smak, nadmierne gazowanie mogą być spowodowane przez bakterie z grupy coli.

Innym produktem z mleka fermentowanego zawierającym alkohol jest kumys, powstający podczas mieszanej fermentacji alkoholowej i mleczno-kwasowej. Jest to cierpki napój o kolorze niebiesko-mlecznym, słodko kwaśnym smaku i charakterystycznym zapachu. Pochodzi z południowych rejonów byłego ZSRR, w Baszkirii, Kazachstanie, Uzbekistanie, Kirgizji, Tatarii, Kałmucji i w Sakha (Jakucja) jest narodowym środkiem leczniczym i ulubionym napojem.

Tradycyjnie wyrabiany jest z mleka klaczy (tzw. kumys naturalny), ale może być również z mleka krowiego, zmodyfikowanego tak, by skład chemiczny (zawartość białka, cukru i tłuszczu) był zbliżony do mleka klaczy (tzw. kumys sztuczny). W zależności od zawartości alkoholu wyróżnia się kumys słaby 1%, średni 1,2% i mocny 3%.

Produkcja kumysu

W celu uzyskania kumysu mleko końskie poddawane jest procesowi fermentacji. Samo łączenie zakwasu z mlekiem jest procesem długotrwałym - 3 godzinnym, gdzie na przemian przez 20 minut trwa mieszanie mleka z zakwasem a przez następne 20 minut faza spoczynku itd. Kumys po wymieszaniu pakowany jest w butelki szklane i poddany procesowi dojrzewania, który trwa 3-4 dni, po czym należy go konsumować. Kumys ma bardzo kwaśny, cytrynowy smak. Wytwarza olbrzymie ilości gazu, tak, że czasami przy otwieraniu musuje jak szampan. Kumys nie nadaje się do transportu na dłuższe odległości, ponieważ butelki mogą eksplodować.

Surowe mleko klaczy zakwasza się gotowym kumysem w ilości około 10%, dokładnie miesza i pozostawia w temperaturze 25-30C°. Po kilku godzinach, z chwilą pojawienia się lekkiego skrzepu, mleko jest silnie bełtane; zabieg ten jest kilkakrotnie powtarzany w ciągu około 8 godzin. Po osiągnięciu kwasowości 24-28°SH, rozbełtany płyn jest rozlewany do hermetycznie zamykanych butelek i poddawany dalszemu dojrzewaniu w temperaturze 6-12°C.

W zależności od stopnia dojrzałości skład kumysu jest następujący (wg W. M. Bohdanowa, Mikrobiologia mołoka i małocznych produktów, Piszczepromizdat, Moskwa, 1949, s. 68):

• kumys słaby (1-dniowy) 24-28 SH; 0,9% alkoholu
• kumys średni (2-dniowy) 32-38 SH; 2,0% alkoholu
• kumys mocny (3-dniowy) 42-46 SH; 2,5% alkoholu

SH czyli Stopień Soxhleta-Henkla, odpowiada objętości w cm3 roztworu wodnego wodorotlenku sodowego o stężeniu molowym równym 0,25 mol/dm3 potrzebnego do zobojętnienia 100 cm³ analizowanego produktu.

Gotowy kumys jest silnie musujący, ma orzeźwiający, czysto kwaśny smak, konsystencję jednolitą, bez osadu. Jego charakterystyczną cechą jest łatwo strawne białko, występujące w postaci bardzo drobnej zawiesiny, głównie albuminy. Poza tym zawiera dużo witaminy C.

Mikroflora kumysu

Mikroflora powodująca fermentację jest podobna do opisanej dla kefiru, ale nie występuje w skupieniach czy ziarnach. Do szczepienia mleka używa się niewielkiej ilości gotowego kumysu.

Mikroflora kumysu składa się z bakterii fermentacji mlekowej i grzybów drożdżowych.

Fermentację mlekową prowadzą prawie wyłącznie laseczki mlekowe typu Lactobacillus bulgaricus (rys). Spotyka się również paciorkowce mlekowe, ale wysoka kwasowość kumysu i mała buforowość mleka kobylego hamują ich rozwój, podobnie jak i rozwój bakterii z grupy coli.

rys. Lactobacillus bulgaricus

Grzyby drożdżowe powodujące fermentację alkoholową zdolne są (w zależności od gatunku):

• do bezpośredniego wykorzystywania laktozy,
• do korzystania z niej na drodze metabiozy.

Do najsilniej fermentujących gatunków należy Torula kumys.

Stosunkowo duża zawartość laktozy w mleku klaczy (do 7%) powoduje, że przy fermentacji alkoholowej powstaje dość dużo alkoholu (2,5%) i dwutlenku węgla, powodującego silne musowanie kumysu. Pomijając wpływ zakażeń, które niewątpliwie rozwijają się w czasie przygotowywania kumysu, cechy charakterystyczne gotowego produktu różnią się znacznie w zależności od czasu dojrzewania. Inkubacja przez 12 do 24 godzin daje zwykle słabo kwaśny produkt ze stosunkowo małą ilością alkoholu. Po kilku dniach inkubacji kwasowość może wzrosnąć do 1%, a zawartość alkoholu osiąga 2%.

Fermentowany napój mleczny pochodzący prawdopodobnie z Indii, nazwa wywodzi się od tureckiego „ya-urt” oznaczającego kwaśne mleko. W odróżnieniu umiarkowanie kwaśnych kefiru i kumysu, jogurt jest szybko ścinającym się, zdecydowanie kwaśnym produktem praktycznie bez alkoholu. Zawiera około 3,3% białka, 2-6% tłuszczu, 3,1% cukru, 0,8% kwasu mlekowego, śladowe ilości alkoholu. W jednej szklance jogurtu znajduje się 415 miligramów bardzo dobrze przyswajalnego wapnia (w mleku odtłuszczonym – 302 mg), witaminy i inne biopierwiastki. Nie zaleca się podawania jogurtu dzieciom przed ukończeniem pierwszego roku życia gdyż zawiera on trudniej przyswajalną formę kwasu mlekowego D-.

Produkcja jogurtu

Przemysłowa produkcja jogurtu rozwinęła się w Europie w początkach XX wieku, po publikacjach Miecznikowa o wpływie spożywania zsiadłego mleka na przedłużenie życia. Pierwsze udane próby popularyzacji jogurtu w USA i Kanadzie znane są od 1940 r.

Jogurt produkowany jest zazwyczaj z mleka zagęszczonego, otrzymanego przez odparowanie części wody lub dodanie 4-5% proszku mlecznego. Produkt otrzymany z takiego mleka jest czasem nazywany „bułgarskim jogurtem” w odróżnieniu od „mlecznego jogurtu” przygotowywanego z normalnego mleka nie zgęszczonego.

Mleko ogrzewa się w celu zredukowania jego mikroflory oraz polepszenia środowiska rozwoju mikroflory jogurtu. Przy produkcji jogurtu z mleka zgęszczonego stosuje się pasteryzację mleka w granicach od 82°C przez 30 minut do 93°C przez 60-90 minut. Dla mleka o normalnej zawartości suchej masy taka obróbka cieplna jest za ostra i powoduje słabą konsystencję produktu. Dla jogurtu tego typu zalecane jest 10-minutowe przetrzymanie mleka w temperaturze 80°C do 90°C. Mleko na jogurt może być pełne lub odtłuszczone. Często przed szczepieniem jest homogenizowane. Po pasteryzacji mleko jest schładzane do temperatury około 48°C i szczepione zakwasem jogurtowym w ilości 2-3%, fermentacja przebiega w temperaturze 42°C do 45°C przez kilka (2,5 do 4) godzin. Czas inkubacji zależy od składu, aktywności i ilości dodanego zakwasu oraz temperatury. Proces trwa do momentu wytworzenia skrzepu i osiągnięcia żądanej kwasowości. Końcowa kwasowość jogurtu zależy od gustu konsumentów, ale najbardziej lubiany jest produkt o kwasowości miareczkowej 0,85 do 0,90%. Aby osiągnąć taką kwasowość, często wyjmuje się jogurt z termostatu w chwili, kiedy wynosi ona 0,65-0,70%. Dalsze ukwaszanie następuje podczas chłodzenia produktu. Jogurt jest schładzany mniej więcej do 5°C i przechowywany w tej temperaturze do czasu sprzedania. W tych warunkach produkt dobrze przechowuje się przez 1-2 tygodnie.

Jogurt może być produkowany metodą zbiornikową (tzw. jogurt mieszany) lub termostatową (tzw. jogurt stały). W celu uzyskania:

• jogurtu stałego - zaszczepione mleko wlewa się do pojemników handlowych, w których zachodzi proces inkubacji.
• jogurtu mieszanego - przeprowadza się fermentację w dużych zbiornikach, wytworzony jogurt delikatnie miesza, dodaje ewentualnie dodatki smakowe i podaje do ogrzewacza, a następnie do maszyny pakującej.

Jogurt mieszany jest podstawą do produkcji jogurtu pitnego. Jogurt pitny bywa poddawany procesowi sterylizacji UHT, przedłuża to jego trwałość, jednak jogurty takie nie zawierają żywych komórek bakterii oraz większości enzymów, co znacznie pogarsza efekt probiotyczny.

Mikroflora jogurtu

Podstawowymi bakteriami zakwasu jogurtowego są Streptococcus thermophilus (rys. poniżej) i Lactobacillus bulgaricus. Niekiedy występują tu, jak i w innych produktach z mleka fermentowanego, inne jeszcze drobnoustroje, ale powyższe dwa gatunki są niezbędne do otrzymania dobrego produktu. Drobnoustroje te powinny występować w zakwasie w ilościach w przybliżeniu jednakowych, inaczej jogurt nie będzie miał najbardziej pożądanej konsystencji, smaku i zapachu. Po wysiewie tej mieszanej mikroflory do mleka paciorkowce szybciej rozwijają się niż laseczki, tak że często w końcu pierwszej godziny inkubacji w temperaturze 45°C paciorkowców jest 3-4-krotnie więcej od laseczek. Tak więc początkowe zakwaszanie jest związane z aktywnością Streptococcus thermophilus. Stopniowo ilość laseczek wzrasta tak, że w końcowym okresie inkubacji liczba ich dorównuje w przybliżeniu liczbie paciorkowców. Wytwarzanie kwasu w ostatnim okresie inkubacji jest dokonywane przez Lactobacillus bulgaricus. Funkcja Streptococcus thermophilus w zakwasie jogurtowym nie jest całkowicie wyjaśniona, poza faktem jego szybszego rozwoju od Lactobacillus bulgaricus i zapoczątkowaniem ukwaszania. Niektórzy badacze twierdzą, że paciorkowce biorą udział w wytwarzaniu smaku i zapachu gotowego produktu. Z drugiej strony, Pette i Lolkema przypisują Lactobacillus bulgaricus wytwarzanie całego aromatu i większości cech smakowych jogurtu. Uważa się, że Streptococcus thermophilus polepsza konsystencję jogurtu zmniejszając charakterystyczną lepkość kultur Lactobacillus bulgaricus na mleku. Jaka by nie była jego swoista rola, Streptococcus thermophilus jest niezbędny do otrzymania jogurtu dobrej jakości. Funkcja Lactobacillus bulgaricus jest lepiej poznana niż paciorkowców. Pette i Lolkema wykazali, że laseczki pobudzają Streptococcus thermophilus do rozwoju przez uwalnianie z białek mleka niezbędnych aminokwasów, zwłaszcza waliny. Wykazali oni również, że Streptococcus thermophilus rosnąc w towarzystwie Lactobacillus bulgaricus produkuje stosunkowo więcej kwasu niż wówczas, gdy rozwija się w czystej kulturze. Laseczki produkują dostateczną ilość kwasu, aby gotowy produkt miał pożądane cechy końcowe, i prócz tego uwalniają substancje lotne nadające jogurtowi typowy smak i zapach. Substancje te nie są całkowicie zidentyfikowane, ale Schulz i inni wykazali związek pomiędzy smakiem jogurtowym i obecnością aldehydu octowego. Ziarniaki wytwarzają kwas mrówkowy i pirogronian oraz dwutlenek węgla z obecnego w mleku mocznika, co stymuluje wzrost pałeczek. Z kolei pałeczki powodują uwalnianie z mleka peptydów i aminokwasów (walina, metionina, lizyna, histydyna, kwas glutaminowy etc.), które wykorzystują do swojego wzrostu ziarniaki, oznaczające się słabymi zdolnościami proteolitycznymi (Dzwolak et al., 2000).

rys. Streptococcus thermophilus

Prowadzenie zakwasu macierzystego

Kultury mogą być otrzymywane albo z kolekcji, albo izolowane z dobrego zakwasu jogurtowego. W tym ostatnim wypadku musi być pewne, że poszczególne wyodrębnione szczepy są zdolne do produkcji dobrego jogurtu. Niektóre autorytety zalecają oddzielne prowadzenie czystych kultur Streptococcus thermophilus i Lactobacillus bulgaricus, następnie mieszanie ich do przygotowywania jogurtu. Wyniki badań Pette i Lolkema wykazują, że nawet jeżeli szczepy są prowadzone oddzielnie, powinny być hodowane razem chociaż przez jeden z ostatnich, przesiewów, przed użyciem do produkcji jogurtu w celu uaktywnienia paciorkowców.

Większość przemysłowych kultur jogurtu składa się z mieszaniny odpowiednich drobnoustrojów. Dystrybutorzy tych kultur zwykle polecają raczej zmianę ich na nowe co tydzień lub 2 tygodnie niż prowadzenie w zakładzie mleczarskim, co połączone jest z ryzykiem zmian charakterystycznych cech zakwasu. Jednakże kultury mieszane mogą być przy dostatecznej uwadze prowadzone przez długi czas bez niepomyślnych zmian ich pożądanej jakości.

Zakwas macierzysty jogurtu powinien być prowadzony na sterylizowanym mleku odtłuszczonym lub pełnym. W celu zachowania pomiędzy obydwoma gatunkami bakterii optymalnego stosunku ilościowego - 1:1 wysiew powinien być dokonany w ilości 2-3%, inkubację przeprowadza się w temperaturze 45°C; kwasowość końcowa powinna wynosić od 0,85 do 0,90%. Zakwas macierzysty należy raczej codziennie przeszczepiać.

Większe odchylenia od tych warunków mogą przyczynić się do silniejszego rozwoju albo paciorkowców, albo laseczek, a tym samym doprowadzić do naruszenia równowagi pomiędzy nimi. Proporcja Streptococcus thermophilus w mieszanej kulturze wzrasta przy:

• słabym ukwaszaniu zakwasu, np. do 0,60%,
• niskiej temperaturze inkubacji, np. 37°C,
• małym wysiewie, np. w ilości 0,1%.

I na odwrót, Lactobacillus bulgaricus staje się dominujący, jeżeli:

• zakwas zostaje silnie ukwaszony,
• temperatura inkubacji jest zbyt wysoka,
• ilość wysiewu jest za duża.

Zakwasy jogurtu powinny być często badane nie tylko na obecność mikroflory zakażającej, ale także na istniejący stosunek laseczek do paciorkowców. Jeżeli stosunek ten nie jest mniej więcej jednakowy, właściwa równowaga może być przywrócona przez modyfikację metody prowadzenia zakwasu, tak aby faworyzowała ona gatunek będący w mniejszości.

Zakwas wtórny przygotowuje się w podobny sposób, przy użyciu większych ilości mleka.

Wady jogurtu

• Chyba najpospolitszą wadą jogurtu jest brak typowego smaku i zapachu. Jeżeli zakwas macierzysty zawiera właściwy stosunek paciorkowców i laseczek, nietypowy smak gotowego produktu zwykle spowodowany jest niewłaściwym ukwaszeniem. Optymalny rozwój cech smakowych występuje tylko wówczas, gdy kwasowość osiąga około 0,85%, ale przy wyższej niż 0,95% otrzymuje się produkt zbyt kwaśny.
• Wytwarzanie składników aromatyzujących występuje w znacznie szerszych granicach kwasowości. Przy użyciu szczepów Lactobacillus bulgaricus, wytwarzających małe ilości związków aromatyzujących, produkt nie będzie miał typowych cech smakowych.

• Nieczysty i gorzki smak powstaje niekiedy w jogurcie wskutek użycia mleka złej jakości lub zakażonego zakwasu. Gorzki smak mogą powodować również niektóre szczepy Lactobacillus bulgaricus.

• Stwierdzono, że powolne ukwaszanie zakwasów jogurtu spowodowane jest zaatakowaniem komórek Streptococcus thermophilus przez bakteriofaga. Uzyskano szczepy fagooporne, ale jogurt przy użyciu tych kultur nie ma pożądanej ścisłej konsystencji.

• Wytwarzanie słabego skrzepu jest poważnym problemem przy wyrobie jogurtu z mleka o normalnej zawartości suchej masy. Według danych Pette i - Lolkema można oczekiwać wytworzenia słabego skrzepu przy niskiej zawartości suchej masy w mleku lub wtedy, gdy znaczna ilość mleka pochodzi od krów we wczesnym okresie laktacji. Również niektóre krowy dają mleko, które słabo krzepnie. Krzepliwość takiego mleka można zwiększyć dodając do niego 1-2% suchego proszku mlecznego lub przeprowadzając przed samym szczepieniem homogenizację mleka przy temperaturze około 54° i pod ciśnieniem 2,1 kg/mm2. Dodatek małej ilości podpuszczki również zwiększa zwięzłość skrzepu, ale psuje smak i strukturę jogurtu.
• Temperatura ogrzewania mleka przed szczepieniem również może wpływać na zwięzłość skrzepu. Pette i Lolkema polecają ogrzewanie do 80-90°C przez 10 minut w celu otrzymania maksymalnej zwięzłości skrzepu.
• Niekiedy, ale nie zawsze, tworzeniu słabego skrzepu towarzyszy wydzielenie serwatki, co według Pette i Lolkema jest spowodowane niewłaściwą równowagą soli w mleku. Badaczom tym udało się znacznie zmniejszyć tę wadę przez obniżenie intensywności obróbki cieplnej do możliwego minimum i dodanie do mleka małych ilości chlorku wapnia.

źródła:

• „Yoghurt: Science and Technology”, A. Y. Tamime, Richard Kenneth Robinson, Opublikowano 1999, Woodhead Publishing, ISBN:1855733994
• voxel.jouy.inra.fr
• Bakterie odporne na bakteriofagi, Mariusz Błoński, źródło: Reuter
• CONTRIBUTION A L'ÉTUDE DE LA BACTÉRIOTHÉRAPIE LACTIQUE Ferments lactiques et laits fermentés par ALEXANDRE NEUKOMM
• Najlepsze Dostępne Techniki (BAT) wytyczne dla branży mleczarskiej, Praca wykonana przez WS ATKINS-POLSKA Sp. z o.o. na zamówienie Ministerstwa Środowiska, Warszawa, kwiecień 2005 r.
• Almanach, Technologia żywności - produkcja piekarsko ciastkarska, rozdz. 10 Mleko i przetwory mleczne.

Postęp nauki i rozwój metod badawczych otworzył nowe możliwości w dziedzinie immunizacji, różnorodność preparatów istniejących na rynku lub będących dopiero w fazie badań, jest tak duża że trudno wprowadzić jakąś jednolitą i spójną klasyfikację. Poniżej niektóre rodzaje szczepionek:

• szczepionki atenuowane - zawierają żywe drobnoustroje o zmniejszonej wirulencji – najlepiej „udają” prawdziwą infekcję, wywołują pełną odpowiedź immunologiczną. ALE: są niebezpieczne - w przypadku osłabionego układu odpornościowego, lub w przypadku zaistnienia mutacji - mogą wywołać chorobę.

• szczepionki inaktywowane - mzrtwe patogeny (i szczepionki acelularne) wywołują przede wszystkim odpowiedź typu humoralnego. Jest ona na ogół słabsza, stosunkowo krótkotrwała.

• szczepionki podjednostkowe (acelularne) - szczepienia całymi mikroorganizmami (zwłaszcza bakteriami) niosą za sobą szereg niebezpieczeństw wywoływanych przez substancje toksyczne jak lipopolisacharydy występujące jednocześnie z antygenami białkowymi. Aby uniknąć poważnych skutków ubocznych z tym związanych stworzono szczepionki podjednostkowe, zawierające zamiast całych bakterii jedno lub niewiele białek antygenowych.
• „Dzisiaj przebojem są szczepionki skojarzone. To wynika z tego, że ludzie nie lubią być kłuci. Obliczyliśmy kiedyś, że gdybyśmy przeciwko każdej chorobie szczepili oddzielnie, to w ciągu pierwszych 2 lat życia dziecko musiałoby otrzymać ok. 37 ukłuć. Dlatego producenci opracowali szczepionki, przy których w jednej strzykawce jest 6–7 antygenów drobnoustrojów chorobotwórczych. To zresztą poważny problem, bo powstają interakcje i np. nie powstają przeciwciała (albo są bardzo słabe w działaniu) przeciwko jednej ze składowych. W Polsce mamy 6-walentne szczepionki przeciwko żółtaczce zakaźnej, błonicy, tężcowi, acelularnemu krztuścowi, polio i Hib. Na świecie są już szczepionki 7- i 8-walentne.”

• szczepionki rekombinowane - organizm immunizowany jest białkiem drobnoustroju uzyskanym metodami inżynierii genetycznej i biologii molekularnej. Produkcję takiego białka można prowadzić przy użyciu wydajnych systemów ekspresyjnych w niepatogennych szczepach np. E. coli, słynna szczepionka przeciwko WZWB zawiera antygen HBs wirusa, produkowany w komórkach drożdży. Największym problemem do przezwyciężenia jest tutaj dobór odpowiedniego antygenu szczepionkowego.

• roślinna szczepionka na Helicobacter pylori - potencjalnym składnikiem takiej szczepionki mogłoby być wiele białek (antygenów) H. pylori, z których najdokładniej została zbadana ureaza, niezbędna do przeżycia bakterii w kwaśnym środowisku żołądka. Wyniki badań wskazują, że możliwe jest wyprodukowanie ureazy w roślinach i ze białko to ma właściwości immunogenne podobne do białka oczyszczonego z bakterii.

• szczepionki DNA - zasada działania jest prosta: DNA (np. w formie plazmidu ekspresyjnego z promotorem eukariotycznym) zostaje podane człowiekowi lub zwierzęciu i wnika do komórek gdzie następuje ekspresja antygenu szczepionkowego. Białko jest wychwytywane przez komórki prezentujące antygen, zarówno w kompleksach z cząsteczkami MHC klasy I, jak i II, zapewniając powstanie zarówno odpowiedzi immunologicznej pośredniczonej przez Th1, jak i Th2. Schemat działania szczepionki DNA przedstawiono na rysunku.

Metody podawania szczepionek DNA:

• Iniekcja domięśniowa
• Iniekcja śródskórna
• Gene-gun (śródskórne podanie drobinek złota opłaszczonych plazmidowym DNA)
• Aerozol podawany do górnych dróg oddechowych
• Iniekcja domięśniowa + elektroporacja

Między licznymi zaletami, główną korzyścią szczepionek DNA, w porównaniu z konwencjonalnymi szczepionkami, jest fakt, że są one w stanie wywołać odpowiedź komórkową, jak i humoralną. Są one często silnie immunogenne, mogą pobudzać mechanizmy odpornościowe, odmienne od naturalnej odpowiedzi immunologicznej, co może być decydującym czynnikiem w ich działaniu. Poza tym, samo otrzymanie antygenu jest stosunkowo łatwe, po sklonowaniu fragmentu cDNA do odpowiedniego wektora można go wytwarzać w znacznej ilości (za pomocą reakcji PCR), a antygen powstający w organizmie immunizowanego osobnika jest identyczny (lub bardzo zbliżony) do natywnego białka patogenu. DNA jest trwałe i termostabilne, nie wymaga utrzymywania niskich temperatur podczas transportu i przechowywania. Koszty szczepionki DNA są stosunkowo niskie, mniejsze niż szczepionek z rekombinowanych białek.

Postęp badań nad szczepionkami DNA:

• Udokumentowane działanie szczepionek DNA u zwierząt przeciwko: wirusowi opryszczki, wirusowemu zapaleniu wątroby (WZW) typu B i C; budzące nadzieję wyniki dot. wirusa HIV-1, antygenów nowotworowych.
• Próby kliniczne (pozytywne) zastosowania szczepionek przeciwko WZW oraz malarii
• Próby kliniczne nad szczepionką DNA przeciw HIV-1 (kilkanaście różnych prób)
• Zaawansowane badania nad zastosowaniem szczepionek DNA w walce z nowotworami
• Zaawansowane badania nad szczepionkami DNA przeciwko pałeczce wąglika i wirusowi Ebola

Ze względu na rozmiar tematu, ograniczę się tu do opisu produkcji szczepionki Weigla przeciw tyfusowi plamistemu, oraz przybliżenia kierunków badań nad szczepionkami terapeutycznymi przeciwnowotworowymi (a dokładnie przeciw rakowi nerki).

• Sczepionka Weigla dlatego że wyprodukowanie jej stanowiło nielada wyczyn, ponadto jej twórca, profesor Rudolf Weigl (1883-1957) zastosował metodę namnażania drobnoustroju która do dzisiaj jest stosowana w nieco zmienionej formie. „Prace Weigla mają również szersze znaczenie niż sama szczepionka. Wesz odzieżowa, podobnie jak większość żywiących się krwią owadów i kleszczy, jest wolna od bakterii, czyli jest, jak się to mówi, aseptyczna. Myśl Weigla, by do hodowli drobonoustrojów żyjących tylko w żywych komórkach zastosować żywe aseptyczne środowisko, utorowała drogę do koncepcji współczesnej hodowli wirusów.”
• Natomiast szczepionki terapeutyczne są czymś zupełnie nowym, szczepienie nie polega w tym przypadku na uodpornieniu w celu zapobiegawczym lecz jest stosowane niejako „po fakcie”, ale o tym później.

Metoda produkcji polegała na hodowaniu zaszczepionych bakteriami tyfusu plamistego (Rickettsia prowazeki) wszy, a następnie wypreparowaniu szczepionki dla ludzi z jelit zarażonych insektów. W okresie wojny Instytut produkował szczepionkę na wielką skalę z przeznaczeniem dla armii niemieckiej i zatrudniał wraz z karmicielami ok. 10 tys. ludzi. Dzięki szczepionce Weigla tyfus plamisty, który w czasie I wojny światowej dziesiątkował armie, w okresie II wojny był praktycznie niegroźny.

Powody użycia wszy do hodowli Rickettsia prowazeki:

• brak sztucznych mediów do hodowli Rickettsia prowazeki
• próba hodowli Rickettsia prowazeki w jajku kurzym zakończyła się niepowodzeniem, wyhodowano mniej immunogenny wariant Rickettsia
• hodowla Rickettsia prowazeki w jelitach Weiglowskiej odmiany wszy (Pediculus vestimenti lub Pediculus humanus corporis) dało w rezultacie najpotężniejszą i godną zaufania szczepionkę przeciwtyfusową (Kryński i in. 1974)

Proces produkcyjny z lat 1939-1945 składał się z następujących etapów:

1. Hodowla zdrowych wszy
2. Zakażanie wszy patogenem
3. Preparowanie wszy i produkcja szczepionki

• Hodowla

Hodowano wszy gatunku Pediculus vestimenti (krzyżówka kaukasko-afrykańska profesora Rudolfa Weigla), który łatwo rozmnażał się i nadawał się dobrze do produkcji szczepionki przeciw tyfusowi plamistemu. Jajeczka wszy inkubowano w temperaturze 32°C. Zdrowe larwy, które wylęgały się po 3 do 8 dniach były przenoszone do płaskich klatek o wymiarach 4×7 cm o grubości tylko około 5 mm, wykonanych z drewna. Jedną ściankę klatki stanowiła siateczka z gazy, tak by wszy mogły wysuwać przez nią główki, ale nie mogły wydostać się z klatki. Około 800 larw było umieszczanych w każdej klatce zawierającej kawałek wełnianej tkaniny (do składania jajek).

Rycina 1: Drewniane klateczki były masowo używane w produkcji.

Wszy, musiały być karmione krwią ludzką. Na nodze (udach lub łydkach) umieszczano od 7 do 11 klatek, ścianką zrobioną z siateczki przyciśniętych do skóry. Wszy wysuwały głowy przez siateczkę, przebijały skórę i ssały krew przez około 45 minut, raz dziennie, przez około 12 dni.

Rycina 2: Karmienie wszy.

Czerwone ślady ukąszeń o wymiarach ok. 2,5×5 cm były przemywane 60% spirytusem, który zawierał jako środek dezynfekujący HgCl2. Karmiciele dobrze znosili stosunkowo niewielki dyskomfort i utratę krwi, wszyscy byli permanentnie i regularnie szczepieni, co chroniło ich przed gwałtownym wybuchem choroby, ale nie zabezpieczało przed łagodniejszymi formami zakażenia, objawiającymi się często wysoką choć krótkotrwałą gorączką. Opieka nad wszami hodowanymi w klatkach Pudełka z klatkami były przechowywane w inkubatorach o temperaturze 32°C w suchych i czystych warunkach. Wszy były przenoszone do czystych i wysterylizowanych klatek, zbierano wtedy jajeczka oraz sprzątano klatkę. Wszystkie działania były wykonywane w ściśle aseptycznych warunkach aby zapewnić zdrowie kolonii wszy, zabezpieczyć je od jakichkolwiek wirusów, bakterii czy innych pasożytów. Mimo tego niekiedy zdarzały się jednak zakażenia mikrobami epidemicznymi, powodując konieczność zniszczenia zawartości takich zakażonych klatek (Kryński, 1967c; Kryński i in. 1974).

Rycina 3: Imadełka Weigla do unieruchomienia wszy używane w produkcji szczepionki przeciwtyfusowej w latach 1941-1944.

• Zakażanie

20 do 50 wszy było unieruchamianych w specjalnym przyrządzie („klamra lub imadełko Weigla”), gdzie każda wesz była przytrzymywana przez bardzo delikatną klamerkę (sprężynkę), dzięki której jej odwłok i odbyt były wyeksponowane i łatwo dostępne. To imadełko było następnie umieszczane pod binokularnym mikroskopem o powiększeniu 32 i każda wesz była doodbytniczo zakażana dawką Rickettsia prowazeki. Jako lewatywka do injekcji służyła mikrokapilara szklana o grubości 0,05 – 0,1 mm (o skośnie ściętym ostrzu, z obtopionym brzegami, dla uniknięcia uszkodzenia odbytu i jelita wszy). Rozmnażanie Rickettsia prowazeki odbywało się w komórkach przewodu pokarmowego wszy. Kiedy populacja Rickettsia prowazeki osiągała 107 na komórkę, komórki jelit zaczynały pękać i następowało przedostawanie się nie strawionej, czerwonej ludzkiej krwi do wnętrza wszy – w wyniku czego w końcowym stadium infekcji wszy przybierały kolor jasno-czerwony.

• Produkcja

Wszy z wysoką ilością Rickettsia prowazeki (te które przybrały kolor czerwony), były umieszczane w słoikach z 0,5% fenolem, oznakowanych jako produkcja szczepionki i w konsekwencji przenoszone do „oddziałów preparatorów”. Tam zakażone jelita wszy wycinano i przenoszono do moździeży Weigla zawierających 0,5% roztwór fenolu, gdzie stopniowo tworzyły delikatną zawiesinę. Następnie wirowano, przy 1000 obr/min były usuwane szczątki jelit, przy 6000 obr/min zawiesina osiadała. Ostatecznie rozpuszczano zawiesinę w buforze 0,5% fenolu. Szczepionka była przygotowana w trzech różnych stężeniach i składała się z bufora, zawierającego emulsję martwych, rozpuszczonych w fenolu Rickettsia prowazeki, równoważną 15, 30 i 45 jelitom wszy. Te trzy stężenia szczepionki były pakowane i dystrybuowane w zatopionych szklanych ampułkach. Cykl szczepienia składał się z trzech zastrzyków, wykonywanych ze wzrastającym stężeniem w odstępach jednotygodniowych i liczących w sumie 90 zakażonych jelit wszy.

„Szczepionka była bezpieczna – z wyjątkiem rzadko występujących poważnych reakcji alergicznych, szczególnie obserwowanych wśród pracowników Instytutu, którzy często byli uczuleni na produkty pochodzące od wszy. Ja osobiście miałem astmatyczną reakcję na rozpylony kał wszy; ponadto ledwie przeżyłem bardzo silny szok anafilaktyczny po trzeciej turze szczepienia.” (Wacław Szybalski)

Rak nerki razem z czerniakiem należy do grupy nowotworów, których rozwój może być kontrolowany poprzez układ immunologiczny — na jego istotną rolę w hamowaniu rozwoju raka nerki wskazują:

• 50-krotnie większa zapadalność na ten nowotwór u osób poddanych długotrwałej immunosupresji (po przeszczepach narządów),
• zaobserwowanie przypadków samoistnej regresji procesu nowotworowego,
• obecność zdefiniowanych antygenów nowotworowych,
• podatność na leczenie czynnikami immunomodulującymi.

Skoro istnieje odpowiedź na antygeny związane z rakiem nerki — to oczywiście prowadzone są badania nad preparatami zdolnymi do wzbudzenia lub wzmocnienia tej odpowiedzi. Działania immunoterapeutyczne w raku nerki obejmują między innymi podawanie szczepionek indukujących swoistą odpowiedź na antygeny nowotworowe. Prowadzone badania kliniczne obejmują szczepionki:

• komórkowe,
• oparte na HSP,
• na bazie komórek dendrytycznych,
• peptydowe.

SZCZEPIONKI KOMÓRKOWE (OPARTE O AUTOLOGICZNE KOMÓRKI NOWOTWOROWE)

Szczepionka jest lizatem komórek nowotworowych pobranych od pacjenta. Autologiczne komórki nowotworowe prezentują antygeny w kontekście MHC klasy I, i mogą tym samym stymulować do odpowiedzi limfocyty T CD8+. Dodatkowo, uwolnione z komórek nowotworowych antygeny po obróbce przez makrofagi i komórki dendrytyczne mogą być prezentowane limfocytom T pomocniczym CD4+.

W celu zwiększenia immunogenności, komórki: - miesza się z bakteriami BCG, - napromienia, - poddaje modyfikacji genetycznej genami cytokin (np: IL-2, GM-CSF)

wady/zalety: Niewątpliwą zaletą takich szczepionek jest stosunkowa duża prostota ich przygotowania i reprezentatywność antygenowa. Mimo ogromnej prostoty szczepionki oparte o autologiczne komórki nowotworowe mają istotne wady: - z medycznego punktu widzenia autologiczne szczepionki są lekami bardzo indywidualnymi i jako takie w znaczący sposób utrudniają porównanie wyników leczenia. - różna zawartość komórek nowotworowych, kompozycja antygenowa i domieszki komórek stromalnych związane z naturalną heterogennością guzów nowotworowych utrudniają standaryzację produktu. - z techniczno-logistycznego punktu widzenia przygotowanie autologicznej szczepionki wymaga wysoce specjalistycznego zaplecza klasy GMP i wyedukowanego personelu, co może utrudniać dostęp do takiej formy terapii i ograniczać ją jedynie do dużych jednostek uniwersyteckich.

SZCZEPIONKI HSP (AUTOLOGICZNE, IZOLOWANE Z GUZÓW NOWOTWOROWYCH BIAŁKA SZOKU CIEPLNEGO)

Białka HSP wykazują co najmniej 2 istotne cechy, które pozwalają im być dobrymi kandydatami na szczepionki, mające zdolność indukcji odpowiedzi limfocytów T cytotoksycznych: - jako białka towarzyszące (chaperonowe), wykazują silną zdolność niekowalencyjnego łączenia się z potencjalnie immunogennymi peptydami będącymi w komórce, - kompleksy HSP-peptyd mają zdolność łączenia się i następnie aktywacji receptora CD91, przez co są silnymi aktywatorami komórek dendrytycznych, które z kolei pełnią centralną rolę w aktywacji swoistej odpowiedzi limfocytów T.

Szczepionki oparte na HSP przygotowuje się indywidualnie dla każdego chorego z lizatu komórek nowotworowych. Zakłada się, że w takim lizacie komórkowym obecne są zmutowane białka, które w istocie mogą być antygenami charakterystycznymi dla konkretnego guza nowotworowego.

wady/zalety: W przeciwieństwie do szczepionek opartych o autologiczne komórki nowotworowe, preparat HSP jest bardziej jednolity w swoim składzie, co daje możliwość lepszej standaryzacji leku i następnie porównania wyników badań klinicznych.

SZCZEPIONKI NA BAZIE KOMÓREK DENDRYTYCZNYCH

Komórki dendrytyczne należą do grupy profesjonalnych komórek prezentujących antygen (APC) i odgrywają kluczową rolę w inicjacji pierwotnej odpowiedzi immunologicznej. Ich ogromny potencjał immunizacyjny wynika z ekspresji cząsteczek kostymulujących, adhezyjnych oraz cytokin niezbędnych do pełnej i prawidłowej aktywacji dziewiczych limfocytów T. Wyizolowane komórki dendrytyczne inkubuje się z antygenami w postaci lizatu komórek nowotworowych czy peptydów (metoda dostarcza gotowych antygenów), przeprowadza ich transfekcję mRNA z komórek nowotworowych lub fuzje z komórkami nowotworowymi (wtedy antygen produkowany jest w komórce i następnie odpowiednio prezentowany limfocytom T).

wady/zalety: - komórki dendrytyczne jako jedyne APC mają zdolność prezentacji pochłoniętych antygenów zarówno w kontekście MHC klasy II, jak i klasy I (cross-priming), co dodatkowo stanowi o ich wartości w indukcji odpowiedzi immunologicznej. - badania na modelach zwierzęcych wykazały, że immunizacja komórkami dendrytycznymi eksponowanymi na peptydy, białka lub mRNA z komórek nowotworowych indukuje bardzo silną, swoistą odpowiedź limfocytów T zarówno cytotoksycznych, jak i pomocniczych. - prostota przygotowania, komórki dendrytyczne można stosunkowo prosto uzyskać ze szpiku kostnego, krwi obwodowej lub pępowinowej. - źródłem antygenów dla komórek dendrytycznych mogą być: - lizaty komórek nowotworowych, - peptydy, - mRNA, - same komórki nowotworowe, które poddaje się fuzji z komórkami dendrytycznymi.

SZCZEPIONKI PEPTYDOWE

Szczepionki peptydowe składają się z krótkich peptydów o odpowiednio dobranej sekwencji aminokwasów, umożliwiającej im połączenie się z cząsteczkami MHC chorego, np. peptyd CA9, będący immunodominującym fragmentem anhydrazy węglanowej, powszechnie występującej w rakach nerki.

Prowadzono próby szczepienia komórkami dendrytycznymi opłaszczonymi peptydem CA9, a także CA9 w postaci bezpośredniej iniekcji razem z niekompletnym adjuwantem Freunda. W pierwszym przypadku nie uzyskano ani odpowiedzi klinicznych, ani odpowiedzi immunologicznej, natomiast w przypadku iniekcji z adjuwantem w większości przypadków uzyskano odpowiedź immunologiczną na peptyd w zakresie aktywacji swoistych limfocytów T cytotoksycznych i produkcji przeciwciał. Silniejszą odpowiedź może wzbudzać antygen MUC-1 opłaszczony na autologicznych komórkach dendrytycznych. W próbie na 20 przypadków w 6 stwierdzono mierzalną odpowiedź na antygen, w badaniach immunologicznych wykryto swoiste limfocyty T oraz stwierdzono rozszerzenie się reakcji immunologicznej na inne antygeny, jak adipoflinę, telomerazę i antygen onkofetalny (epitope spreading).

wady/zalety: - niezbędna znajomość sekwencji immunodominującego peptydu antygenu nowotworowego, która określa jego zdolność do wiązania się z MHC. - ze względu na restrykcję MHC (peptyd o danej sekwencji łączy się ze ściśle określonym typem HLA), szczepionki tego typu mogą mieć zastosowanie tylko w wyselekcjonowanej pod kątem układu HLA grupie chorych. - szczepionki peptydowe indukują odpowiedź immunologiczną na jeden wybrany antygen, są zatem szczepionkami monowalentnymi, o bardzo wąskim zakresie działania.

Źródła:

• Współczesna Onkologia (2007) vol. 11; 3 (160–166),
• „Szczepionki terapeutyczne w raku nerki” Dariusz W. Kowalczyk, Zakład Immunologii Nowotworów, Uniwersytet Medyczny im. K. Marcinkowskiego w Poznaniu, Wielkopolskie Centrum Onkologii.
• http://kbn.icm.edu.pl/pub/kbn/eureka/0101/42.html
• http://www.biotechnologia.pl/biotechnologia/9/977
• Wacław Szybalski, Wykorzystanie wszy laboratoryjnych karmionych przez ludzi dla produkcji szczepionki Weigla przeciw tyfusowi plamistemu. Maintenance of Human, Animal, and Plant Pathogen Vectors. Science Publishers, Inc., Enfield, NH, USA (1999). Str. 161-180
• Stefan Kryński, „Był w nauce artystą”, Artykuł opublikowany w tygodniku „Polityka” rok 1978 (XXII), nr 24 (1111) str.14
• Kosmos, Tom 54 2005, Numer 1 (266), Strony 123–130
• Szczepionki w chorobach alergicznych, aai_volume-5_issue-1_article-104
• „Ludzie nie lubią być kłuci”, Rozmowa z prof. dr hab. med. Jackiem Wysockim, kierownikiem Katedry Profilaktyki Zdrowotnej oraz prorektorem Akademii Medycznej w Poznaniu, przewodniczącym Polskiego Towarzystwa Wakcynologii, opublikowana w Przewodniku lekarza.
• http://www.piskaczu2.webpark.pl/terapia.html