Organizmy metylotroficzne to wyjątkowa grupa drobnoustrojów, zdolna do wykorzystywania związków jednowęglowych innych niż CO2 (lub kilkuwęglowych nie zawierajacych wiązań C-C) jako źródła energii. Mikroorganizmy takie występują powszechnie w glebie i wodzie, więc jak można się domyślać, są tlenowcami. Wśród metylotrofów szczególną grupę stanowią metanotrofy, jak sama nazwa wskazuje, wykorzystujące metan.

Związki wykorzystywane przez metylotrofy zestawia Tabela 1.

Substraty wykorzystywane do wzrostu

Co to jest?!

Substraty utleniane, ale nie wykorzystywane do wzrostu

Co to jest?!

Metan

Click me!

Amoniak

Click me!

Metanol

Click me!

Etylen

Click me!

Metyloamina

Click me!

Chlorometan

Click me!

Dimetyloamina

Click me!

Bromometan

Click me!

Trimetyloamina

Click me!

Inne węglowodory (etan, propan…)

Click me!

Jon tetrametyloamonowy

Click me!

-

-

Trimethylamine N-oxide

Click me!

-

-

Jon trimetylosulfonowy

Click me!

-

-

Kwas mrówkowy

Click me!

-

-

Amid kwasu mrówkowego

Click me!

-

-

Tlenek węgla

Click me!

-

-

Eter dimetylowy

Click me!

-

-

Węglan dimetylu

Click me!

-

-

Dimetylosulfotlenek

Click me!

-

-

Siarczek dimetylu

Click me!

-

-

Tabela 1. Związki wykorzystywane przez mikroorganizmy metylotroficzne. Wszystkie powyższe związki nie są wykorzystywane przez każdą bakterię metylotroficzną, są tu przytoczone, jeżeli wykazano ich użycie przez przynajmniej jeden gatunek. Jak wspominano, metylotrofy używajace metanu określamy mianem metanotrofów. Linki prowadzące do stron anglojęzycznej Wikipedii często mają swoje polskie odpowiedniki. Należy to sprawdzić po lewej stronie witryny, w dziale languages W tabeli zamieszczono hiperłącza do angielskiej wersji stron, ponieważ z reguły są one bogatsze.

Organizmy metylotroficzne znajdziemy zarówno pośród bakterii, jak i grzybów. Choć wiele z nich to tlenowce, spotkać można również takie, o beztlenowym metabolizmie. Wyróżniamy ponadto metylotrofy:

• Heterotroficzne: mogą rosnąć na związkach wielowęglowych
• Obligatoryjne: nie mogą rosnąć na związkach wielowęglowych ani CO2
• Autotroficzne: utleniają zredukowane związki wielowęglowe do CO2 i utylizują w cyklu Calvina

Z kolei związki wykorzystywane przez metylotrofy mogą:

• być produkowane przez rośliny - metanol
• pochodzić z rozkładu szczątków roślinnych i zwierzęcych (ryby) - metyloaminy
• być produkowane przez glony - pochodne metylowe, w tym siarczany metylu

Przykładowe metylotrofy zestawia Tabela 2.

Candida boidinii to metylotroficzny drożdż, który obok takich organizmów jak Pichia pastoris czy Hansenula polymorpha, jest zdolny do życia z wykorzystaniem metanolu jako jedynego źródła węgla. Czyni to ja dogodnym drobnoustrojem do produkcji białek (por. Dlaczego metylotrofy?). Szczególną zaletą jest natywny system indukcji ekspresji genów pod wpływem metanolu, który można zmodyfikować metodami inżynierii genetycznej, otrzymując wygodny sposób kontrolowania ekspresji pożądanych genów. Uzyskano już wiele zmodyfikowanych szczepów C. boidinii, głównie poprzez mutagenezę z wykorzystaniem UV.

Methylococcus capsulatus jest metylotroficzną gramujemną bakterią zdolną do utylizacji, oprócz metanu, również cukrów (niepewne, ale wykazano ekspresję enzymów, które mogłyby za to odpowiadać), siarki i niektórych związków nieorganicznych. Toleruje niskie stężenia tlenu. Jest jednym z ulubionych modeli badawczych z uwagi na szybki wzrost na metanie i stosunkowo prosty do wykorzystania system genetyczny. Genom tego mikroorganizmu, o wielkości 3,3 Mb, został w całości zsekwencjonowany.

Jak w przypadku wielu innych bakterii, początkowa klasyfikacja matanotrofów opierała się na ich morfologii oraz na rodzajach tworzonych przez nie form przetrwalnych. Wraz z rozwojem metod mikrobiologicznych dokonano podziału tych drobnoustrojów na podstawie ich budowy wewnątrzkomórkowej oraz szlaków asymilacji węgla. W ten sposób wyróżniono 2 typy, których cechy zestawia Tabela 2.

Tabela 2. Porównanie cech typów I i II metanotrofów.

Bakterie obu typów należą do Proteobacteria, jednak przynależność do różnych podgrup pod względem rodzaju podjednostki 16S rRNA wskazuje na ich oddalenie filogenetyczne.

Rysunek 1. (Po lewej) Zdjęcie mikroskopowe bakterii z rodzaju Methylosinus - typ II. Widoczny rozbudowany system błon na peryferiach komórki. Źródło

Rysunek 2. (Po prawej) Zdjęcie mikroskopowe Methylococcus capsulatus, bakterii metanotroficznej typu I. Widoczne struktury błoniaste wewnątrz komórki. Źródło

Metanotrofy to szczególna grupa metylotrofów, zdolna do utylizowania samego metanu (czasem obok innych jego pochodnych). Tak silnie zredukowany związek jest w pierwszym etapie metabolizmu utleniany do metanolu przez specyficzny dla tej grupy organizmów enzym - monooksygenazę metanu. A zatem to właśnie metanol jest wykorzystywany w kolejnych procesach. Procesy te są możliwe dzięki rozbudowanym systemom błon wewnętrznych obecnych w tych bakteriach. To właśnie potrzeba utleniania metanu czyni matanotrofy obligatoryjnymi tlenowcami (aczkolwiek wykazano także możliwość anaerobowego utleniania tego związku, por. Utlenianie bez tlenu). Co ciekawe, organizmy tę częstokroć są również „obligatoryjnymi jednowęglowcami” - nie są w ogóle zdolne do wykorzystywania związków zawierających wiązania C-C. (Inne metylotrofy potrafią wykorzystywać bardziej złożone związki węgla, jak cukry czy kwasy organiczne).

Utylizacja amoniaku

Poza utlenianiem metanu, metanotrofy są zdolne do utleniania amoniaku. Jest to możliwe dzięki funkcjonowaniu tego samego enzymu, który służy utlenianiu metanu, czyli monooksygenazie metanu. Oba substraty konkurują ze sobą o dostęp do miejsca aktywnego enzymu. Ta kompetycja może się okazać toksyczna dla metanotrofów w wyższych stężeniach amoniaku, jako że nie są wówczas w stanie asymilować metanu. Z tej również pryzczyny preferowanym przez te bakterie źródłem azotu jest tlenek azotu (V).

W związku z tą bifunkcjalnością monooksygenazy metanu oraz podobieństwem systemów wewnątrzkomórkowych błon do tych występujących u bakterii nitryfikacyjnych, postuluje się możliwość wyewoluowania metanotrofów poprzez mutację przekształcającą monooksygenazę amoniaku w monooksygenazę metanu. Z drugiej jednak strony, bakterie metanotroficzne posiadają geny wykazujące wysoką homologię z genami produkujących metan archebakterii, syntetyzują też część takich samych białek.

Utlenianie bez tlenu?

Ciekawą zależność wykazały badania przemian metanu w środowiskach morskich. Okazuje się, że metan może być utleniany w warunkach beztlenowych, mówimy wówczas o beztlenowym utlenianiu metanu - AOM (ang. Anaerobic Oxidation of Methane). Zjawisko takie obserwuje się w konsorcjach bekteryjnych złożonych z gatunków Archea (utleniających metan) oraz bakterii redukujących siarczany. Co ciekawe, do tej pory niektóre archeabakterie uważano raczej za producentów metanu. Dlatego też mechanizm utleniania przez nie tego związku pozostaje enigmatyczny. Najczęściej postuluje się, że mikroorganizmy te wykorzystują odwrócony szlak produkcji metanu w celu jego utlenienia, wytwarzając przy tym dwutlenek węgla i drugi, nieznany na razie metabolit. To właśnie ten drugi związek ma być teoretycznie wykorzystywany przez partnerów symbiozy, bakterie redukujące siarczany.

Ekologia metanotrofów

Metanotrofy występują powszechnie w glebie i wodzie, wszędzie tam, gdzie obecne są stabilne źródła metanu. W przypadku środowisk wodnych, metan może być uwalniany z głębszych warstw, gdzie jest produkowany - metanotrofy występują zwykle w rejonie termokliny (Co to jest?), gdzie metan wędrujący w górę spotyka się z docierającym z powierzchni tlenem. Metanotrofy odgrywają więc niebagatelną rolę w cyklu przemian węgla, przetwarzając metan do bardziej złożonych związków budujących komórkę oraz do dwutlenku węgla.

Rysunek 3. Cykl obiegu węgla w przyrodzie. Źródło

Metanotrofy jako symbionty

Stwierdzono symbiotyczne oddziaływania pomiędzy bakteriami metanotroficznymi a pewnymi morskimi organizmami, w tym gatunkami morskich gąbek oraz małży. Małże żyją w sąsiedztwie wycieków węglowodorowych, gdzie metan jest uwalniany w znaczących ilościach. Zarówno całe małże, jak też ich wyizolowane skrzela, wykazują wysokie tempo konsumpcji metanu w warunkach tlenowych. Szczególnie w tkance budującej skrzela tych zwierząt występują znaczne ilości bakterii o morfologii ziarniaków i systemie błon wewnętrznych charakterystycznym dla typu I metanotrofów. Dokładniej występują one w wakuolach komórek skrzeli położonych blisko ich powierzchni, a zatem w miejscu umożliwiającym efektywną wymianę gazową z obmywającą skrzela wodą. Małże, a zapewne również gąbki, żyjące w symbiozie z metanotrofami, wykorzystują najprawdopodobniej wydzielane przez nie związki węglowe.

Rysunek 4. Małż, przykład organizmu wykazującego symbiozę z bakteriami metanotroficznymi. Źródło

Populację metanotrofów można uzyskać poprzez hodowlę na zwykłym medium z zastosowaniem atmosfery w 80% złożonej z metanu (pozostałe 20% stanowi powietrze). Po uzyskaniu odpowiedniego wzrostu, bakterie są oczyszczane poprzez przesiewanie na nowe pożywki mineralne i inkubację z mieszaniną powietrza z metanem. W takich warunkach uzyskuje się dwa rodzaje hodowli. Pierwszy to zwyczajne chemoorganotrofy, wykorzystujące śladowe ilości związków organicznych obecne w pożywce i pojawiające się po ok. 1-2 dniach. Drugi to metanotrofy, pojawiające się po ok. tygodniu hodowli, których kolonie wykazują często różowe zabarwienie dzięki produkowanym przez nie keratonoidom. Czyni je to dość łatwymi w dalszej izolacji.

Monooksygenaza metanu (MMO, ang. methane monooxygenase) należy do oksydoreduktaz. Występuje w dwóch, dobrze poznanych formach: cząsteczkowej (particulate, pMMO) i rozpuszczalnej (soluble, sMMO). Miejsce aktywne rozpuszczalnej formy zawiera centrum złożone z dwóch atomów żelaza, zmostkowanych przez atom tlenu, podczas gdy w formie nierozpuszczalnej prawdopodobnie występuje miedź. Strukturę centrum aktywnego przedstawia Rysunek 4. Atomy żelaza są utrzymywane wiązaniami koordynacyjnymi z dwiema histydynami i dwoma kwasami glutaminowymi oraz cząsteczka wody.

Rysunek 4. Centrum żelazowe monooksygenazy metanu, kolejno w stanie: podstawowym (spoczynkowym), utlenionym i zredukowanym. Źródło

Badania krystalograficzne wykazały, że MMO jest dimerem zbudowanym z trzech podjednostek. Cząsteczka jest stosunkowo płaska, o wymiarach 60x100x120 A (angstrom). Przez cząsteczkę przebiega także zagłębienie. Miejsce, w którym ulokowane jest centrum aktywne, stanowią hydrofobowe kieszenie, jednak droga wnikania tam metanu nie jest jeszcze dokładnie poznana. Prawdopodobnie konieczna jest zmiana konformacji, wywoływana wiązaniem białka pomocniczego i być może obecnością substratu, aby mógł on wniknąć do miejsca aktywnego enzymu i tam pozostać tak długo, jak jest to konieczne.

Po wniknięciu substratu pierwsze zmiany w centrum prowadzą do zredukowania MMO i utlenienia atomów żelaza do IV stopnia utlenienia, co zmienia ich charakterystykę z ferromagnetyków do antyferromagnetyków.

Rysunek 5. Nierozpuszczalna forma monooskygenazy metanu. Źródło

Jak już wspomniano, pierwszą reakcją mechanizmu działania MMO jest jej redukcja. W tym stanie atomy żelaza w centrum aktywnym sa zdolne do reakcji z tlenem cząsteczkowym i tworzy się produkt pośredni (na rysunku Intermediate P), najprawdopodobniej w formie nadtlenku, w którym atomy tlenu związane są symetrycznie. Forma P ulega konwersji w formę Q (Intermediate Q), zawierającą 2 antyferromagnetyczne wysokospinowe centra żelazowe Fe(IV). Forma ta jest kluczowa dla przeprowadzenia reakcji utleniania alkanu (tu metanu).

Sugeruje się 2 możliwe mechanizmy tej reakcji - rodnikowy i nierodnikowy. Mechanizm rodnikowy zaczyna się od odłączenia od substratu (metanu) atomu wodoru i utworzenia formy QH. Jest to najwolniejszy etap, determinujacy prędkość całego procesu. Oprócz QH tworzą się forma Q z mostkiem hydroksylowym i wolny rodnik alkaliczny. W mechanizmie nierodnikowym dochodzi do powstania specyficznej formy Q, Wodoroalkilu Q, poprzez czterocentrowy stan pośredni. Badania wskazują jednak (1999) na poprawność pierwszego z przytoczonych mechanizmów.

Prawdopodobnie przejście do rodnika wymaga torsyjnego ruchu grupy hydroksylowej zanim rodnik metylowy przyłączy zmostkowaną grupę OH i utworzy alkohol. Gdy zbliża się rodnik, atom wodoru alkanu zmienia swoje położenie tak, że zmianie ulega z kolei otoczenie atomu tlenu.

Ostatni etap reakcji polega na eliminacji alkoholu i regeneracji katalizatora. Może do tego dojść na kilka sposobów. Może to być stopniowy mechanizm, zaczynający się od eliminacją alkoholu i pośredniej formy Fe-O-Fe, poprzez eliminację wody, a kończący się regeneracją enzymu wskutek redukcji 2e-. Alternatywna droga miałaby polegać na początkowej redukcji jednego z atomów tlenu, z utworzeniem cząsteczki wody, po czym następowałaby eliminacja alkoholu i regeneracja enzymu. Ponadto możliwa jest spontaniczna eliminacja metanolu, pociągająca za sobą redukcję atomu tlenu przez 2e- i regenerację katalizatora.

Rysunek 6. Schemat cyklu działania monooksygenazy metanu. Źródło

Powyżej opisano funkcjonowanie rozpuszczalnej formy MMO, sMMO, wraz z mechanizmem działania jej centrum żelazowego. Jednakże forma cząsteczkowa MMO, pMMO, jest niemniej istotna w metabolizmie metanotrofów i wykazuje wysoką wydajność działania. Podstawową różnicą pomiędzy sMMO i pMMO jest to, że ta druga w centrum aktywnym wykorzystuje miedź (Cu). Cu stanowi nie tylko element enzymu, ale jest również regulatorem jego ekspresji.

Mikroorganizmy metanotroficzne mogą się różnić zdolnością do pobierania miedzi z otoczenia. Efektywność samego pobierania natomiast jest zależna od źródła miedzi. Istotne w tym procesie wydaje się białko mb, metanobaktyna (methanobactin) - mały fluorescencyjny chromopeptyd, wyizolowany jak dotąd (2007) tylko z Methylosinus trichosporium OB3b, ale obserwowany także w innych gatunkach, np. Methylococcus capsulatus. Białko mb miałoby pośredniczyć w przyswajaniu miedzi, jak również promować ekspresję pMMO. W związku z tym, ekspresja pMMO może być uzależniona od szybkości przyswajania miedzi, która z kolei (jak wspomniano) jest zależna od źródła miedzi w otoczeniu bakterii. Ponadto białko mb odgrywa prawdopodobnie rolę w ochronie komórki przed toksycznym działaniem miedzi.

Użycie miedzi w centrum aktywnym jest uzasadnione jej reaktywnością - jako że metan jest substratem silnie zredukowanym, konieczny jest wysoki potencjał redoks, by uległ utlenieniu. Wykorzystanie miedzi pociąga jednak za sobą konieczność wykształcenia systemów zapobiegających jej toksycznemu oddziaływaniu na komórkę. Stąd wyżej opisane białko mb, zdolne do wiązania miedzi, wydaje się idealnym rozwiązaniem, buforując ilość miedzi zarówno w otoczeniu komórki, jak i jej wnętrzu. Jednocześnie selektywne pobieranie Cu zapewnia prawidłowe funkcjonowanie w niszach, bogatych jednocześnie w inne metale, dokładniej tlenki Fe czy Mn, powstające wskutek intensywnych przemian redox w otoczeniu metanotrofów.

Metylotrofy są stosunkowo mało wymagającymi organizmami, przystosowanymi do wzrostu na dość ubogich pożywkach (por. Produkcja białek). Związki C1 z kolei są z reguły tanim substratem. Do najpowszechniej stosowanych należy metanol, atrakcyjny ze względu na swoją niską cenę, wysoką czystość oraz łatwość transportu czy przechowywania. Może być otrzymywany np. z gazu naturalnego, nie konkurując o zasoby z produkcją żywności. Dlatego też organizmy zdolne do wzrostu i metabolizmu opartych na metanolu stały się istotnymi producentami we współczesnej biotechnologii.

Pichia pastoris jako producent białek (rekombinowanych)

Początki inżynierii genetycznej splatają się z pierwszymi próbami produkcji białek rekombinowanych czy to w celach badawczych, czy w celu zastosowania terapeutycznego, m.in. w terapii chorób genetycznych.

Początkowo organizmem z wyboru była dobrze poznana Escherichia coli. Ta prosta jednokomórkowa bakteria wydawać się może idealnym producentem białka: jest zdolna do szybkiego bezpłciowego namnażania się (populacja podwaja się w około godzinę) oraz stosunkowo łatwa w transformacji plazmidami, niosącymi gen wybranego przez nas białka.

Problemem okazała się produkcja białek eukariotycznych, a to ze względu na różnice w obróbce potranslacyjnej białek w organizmach prokariotycznych i eukariotycznych. Białka Eukariota produkowane w E. coli były niefunkcjonalne z powodu nieprawidłowego sfałdowania, glikozylacji itp. W związku z tym białka takie próbowano produkować np. w Saccharomyces cerevisiae, kolejnym powszechnie stosowanym w biotechnologii mikroorganizmie. Jako gatunek Eukariota, drożdże te zdolne są do prawidłowej obróbki posttranslacyjnej i wytwarzania funkcjonalnego białka. Istnieje jednak szereg ograniczeń produkcji białka w S. cerevisiae, w tym niska wydajność produkcji czy fakt, że produkowane białko jest zazwyczaj toksyczne dla komórek i ogranicza ich wzrost. Idealnym rozwiązaniem byłby zatem system pozwalający na indukcję produkcji białka dopiero wtedy, gdy uzyskamy odpowiednią ilosć drobnoustrojów. Optymalna byłaby natomiast możliwość wykorzystania endogennego systemu drobnoustroju.

S. cerevisiae nie posiada niestety takiego systemu indukcji, który można by efektywnie wykorzystać. Dalszy skrining przyniósł interesujące odkrycie, mianowicie nowy gatunek drożdży – Pichia pastoris. P. pastoris jest metylotrofem wykorzystującym metanol, zdolnym jednak do wzrostu również na innych substratach. W związku z tym ekspresja enzymów przetwarzających metanol jest indukowana jedynie wówczas, gdy związek ten jest obecny w otoczeniu bakterii. Co istotne, inicjacja ekspresji tego genu podlega silnemu promotorowi. W związku z tym umieszczony pod nim gen białka będzie nie tylko ekspresjonowany w sposób indukowalny, ale również ekspresja taka będzie stosunkowo silna, a więc prawdopodobnie uzyskamy zadowalającą ilość produktu białkowego.

Rysunek 7. Pichia pastoris. Źródło

Jak wspomniano Pichia pastoris ma zdolność wykorzystywania metanolu jako źródła węgla. W związku z tym, w odróżnieniu od opisywanych wyżej metanotrofów używających monooksygenazy metanu, wykorzystuje oksydazę alkoholową, utleniającą metanol do formaldehydu i nadtlenku wodoru. Występują dwie formy tego enzymu, AOX1 i AOX2, obie ściśle regulowane na poziomie transkrypcji. Gdy drożdże te są np. hodowane na glukozie lub etanolu, nie dochodzi do ekspresji wyżej wymienionych enzymów. Również w przypadku hodowli na glicerolu niewykrywalne jest mRNA żadnej z form. Kiedy jednak w pożywce obecny jest metanol, oksydaza alkoholowa stanowić może aż do 30% całkowitego białka w komórce.

Obie formy oksydazy wykazują silną homologię na poziomie DNA (92%) i sekwencji aminokwasowej (97%). Wyraźna różnica pomiędzy AOX1 i AOX2 dotyczy natomiast promotorów kontrolujących ekspresję obu form – wykazują bardzo niską homologię, jednak prawdopodobnie mechanizm ich działania jest zbliżony: zawierają region represorowy hamujący ekspresję oraz region wzmacniający ekspresję. W produkcji białek stosowany jest promotor AOX1. Enzymy te są składowane w peroksysomach, których akumulacja w komórkach jest kolejnym znacznikiem obecności metanolu w środowisku i mogą zajmować nawet do 80% objętości komórki.

Podsumowując zatem kwestię systemu indukcji należy zauważyć, że metanol stanowi zarówno induktor biosyntezy pożądanego produktu, jak też efektywnie przyswajane przez P. pastoris źródło węgla.

Bardzo istotną cechą produkowanych białek jest ich glikozylacja, szczególnie w odniesieniu do terapeutycznego zastosowania otrzymywanego produktu, jako ze wzór glikozylacji jest jednym z najważniejszych czynników immunogennych. Wynika z tego kolejna trudność dotycząca produkcji białek w drożdżach gatunku S. cerevisiae, mianowicie często otrzymywano produkty zdolne do immunizacji biorcy, a zatem bezużyteczne pod względem terapii. P. pastoris glikozyluje produkowane białka w sposób podobny do S. cerevisiae, dodając łańcuchy o wysokiej zawartości reszt mannozy, jednak stosunkowo krótkie. Najdłuższe łańcuchy cukrowe powstające w P. pastoris zwierają ok. 30 reszt, podczas gdy w przypadku S. cerevisiae ich liczba zawiera się pomiędzy 50 a 150. Być może wpływa to na immunogenność powstających białek. Poza tym P. pastoris nie zawiera enzymu odpowiedzialnego za tworzenie wiązań alfa-1,3 pomiędzy resztami mannozy (transferazy alfa-1,3-mannozylu) i powstające łańcuchy są wolne od takich połączeń. Natomiast są one obecne w łańcuchach tworzonych przez S. cerevisiae, podczas gdy wykazano, że stanowią one jeden z silnych potencjalnych antygenów.

Kolejnym plusem P. pastoris jest to, że jest zdolna do wzrostu na stosunkowo ubogiej pożywce mineralnej, osiągając przy tym wysoką gęstość hodowli. Dodatkowo wydziela niewielką ilość białek na zewnątrz komórki. Jeżeli więc odpowiednio zmodyfikujemy „nasze” białko – tak, aby było wydzielane do pożywki – dalsze oczyszczanie będzie stosunkowo proste.

Poniżej zestawiono cechy P. pastoris czyniące ją znakomitym układem do produkcji heterologicznych (i eukariotycznych) białek.

Cechy Pichia pastoris czyniące ją atrakcyjnym układem do produkcji heterologicznych (eukariotycznych) białek:

• jednokomórkowiec (zaliczany do drożdży) – szybkie rozmnażanie
• opracowana metodyka hodowli i transformacji (w ogromnej mierze zaczerpnięta z metodyki S cerevisiea)
• zdolność dokonywania modyfikacji potranslacyjnych charakterystycznych dla Eukariota
• korzystna charakterystyka glikozylacji białek (stosunkowo obniżona immunogenność)
• silny indukowalny promotor (promotor AOX1)
• induktor syntezy pożądanego białka – metanol – stanowi jednocześnie źródło węgla i energii (choć oznacza to jednocześnie konieczność ciągłego suplementowania pożywki w bardziej długotrwałych procesach fermentacji)
• niskie wymagania co do składu pożywki przy wysokiej gęstości hodowli
• przy odpowiednio zaprojektowanym konstrukcie (peptyd sygnalny warunkujący wydzielanie białka) stosunkowo proste oczyszczanie produktu
• zdolność integracji plazmidu ekspresyjnego z genomem komórek
• dostępny komercyjny zestaw do ekspresji białka (Invitrogen Co)

Fermentacja P. pastoris

Fermentacja z udziałem P. pastoris jest prowadzona w reaktorach typu fed-batch. Wyróżniamy 2 typy szczepów P. pastoris, różniące się własnościami biochemicznymi (kinetyką utylizacji metanolu) i w związku z tym hodowane na różne sposoby:

• szczepy MutS (methanol utilization slow) – używana jest mieszanina glicerolu (główne źródło węgla i energii) i metanolu (induktor ekspresji genu białka); stężenie metanolu jest utrzymywane na niskim poziomie;
• szczepy Mut+ (methanol utilization plus) – metanol jest sam źródłem węgla i energii dla komórek; aktualnie ten typ szczepów służy produkcji ponad 400 różnych białek rekombinowanych.

Schemat hodowli P. pastoris przedstawia Rysunek 8. Najczęściej stosowana procedura (szczep Mut+) składa się z 4 etapów. W pierwszym priorytetem jest uzyskanie jak największej biomasy komórek. W tym celu prowadzi się hodowlę na glicerolu jako źródle węgla. W następnej fazie zaczyna się dostarczać glicerol na zasadzie fed-batch, by jeszcze zwiększyć masę komórkową, jednocześnie wprowadza się już induktor, czyli metanol. Metanol jest w trakcie tej fazy przejściowej podawany w niewielkim stężeniu, natomiast dostarczanie glicerolu zostaje z czasem przerwane (lub jest kontynuowane na poziomie nie wywołującym represji). Ostatnia faza to faza produkcyjna, wymagająca ciągłego suplementowania metanolem. Opracowano wprawdzie metody wykorzystujące zmieszane glicerol i metanol , jednak typowa strategia fermentacji wykorzystuje raczej sam metanol jako źródło węgla i energii na etapie produkcji.

Rysunek 8. Hodowla Pichia pastoris. Źródło

Media używane w hodowli P. pastoris mogą się zatem różnić w zależności od celu hodowli, użytego szczepu i etapu procesu. Przykłady takich pożywek zestawia Tabela 3.

Tabela 3. Przykłady pożywek dla P. pastoris.

Metanol stanowi dla P. pastoris źródło węgla. Niemniej jednak w zbyt wysokich stężeniach staje się inhibitorem wzrostu (4-6mg/l). Zbyt niskie stężenie natomiast będzie prawdopodobnie negatywnie wpływało na wydajność produkcji. Dlatego konieczny jest monitoring stężenia metanolu w hodowli bioreaktorowej podczas etapu produkcji. Przykład bioreaktora z systemem kontroli stężenia metanolu przedstawia Rysunek 9. Rysunek 10 pokazuje przykład systemu kontroli metanolu w bioreaktorze.

Rysunek 9. Przykład bioreaktora fermentacyjnego. Źródło

Rysunek 10. Przykład systemu kontroli stężenia metanolu. [8]

Oczywiście stężenie metanolu nie jest jedynym parametrem wymagającym monitoringu. Parametry istotne w ferementacji P. pastoris zestawia Tabela 4.

* objętość tlenu (l) na objętość kultury (l) na minutę

Tabela 4. Parametry istotne w procesie fermentacji z udziałem P. pastoris. [11]

Ważnym zastosowaniem organizmów metylotroficznych, choć może na mniejszą skalę niż użycie P. pastoris, jest produkcja aminokwasów. Dobrze znane przykłady takich drobnoustrojów to chociażby Bacillus methanolicus produkujący L-lizynę, czy też Methylobacillus glycogenes, zdolny (po modyfikacjach) do produkcji kwasu L-glitaminowego, L-treoniny i L-lizyny. Innym organizmem metylotroficznym wykorzystywanym do produkcji L-lizyny jest Methylophilus methylotrophus.

Jak widać jednym z najczęstszych produktów jest L-lizyna. Jest to aminokwas produkowany w ilości ok. 6 x 10^5 ton na rok, na skalę przemysłową przez Coryne-bakterie, przede wszystkim Corynebacterium glutamicum produkującym wydajnie L-lizynę z cukru czy skrobi kukurydzianej. Substraty te są jednakże stosunkowo drogie, dlatego zyskują coraz większe znaczenie organizmy zdolne produkować te same substancje z tańszych surowców (por. Dlaczego metylotrofy?).

Methylophilus methylotrophus

Methylophilus methylotrophus jest obligatoryjnym metylotrofem, przetwarzającym formaldehyd powstały w wyniku utleniania metanolu dzieki aktywności RuMP (monofosfatazy rybulozy). Po intensywnych badaniach w latach 70. ubiegłego wieku używany był na skalę przemysłową do produkcji białka. Aktualnie zwraca się uwagę na jego zalety pod względem zastosowania w przemyśle produkcji aminokwasów, w szczególności L-lizyny. Należą do nich: szybki wzrost (wg niektórych najszybszy pośród metylotrofów) z dobrym odzyskiem w umiarkowanie wysokich temperaturach, brak patogenności, oraz fakt, że większość metod, szczególnie technik modyfikacji genetycznych, opracowana dla Escherichia coli, może być użyta do pracy z M. methylotrophus (por. wyżej P. pastoris i S. cerevisiae). Własności te czynią M. methylotrophus hipotetycznie dobrym gospodarzem do produkcji wielu substancji z metanolu.

Methylophilus methylotrophus stał się również jednym z organizmów badanych pod kątem produkcji L-lizyny. Szlak produkcji aminokwasu przez tę bakterię przedstawia Rysunek 11.

Rysunek 11. Szlak biosyntezy L-lizyny przez M. methylotrophus. [12]

Jak w przypadku wielu innych substancji, nadrzędnym celem w wypadku Methylophilus methylotrophus jest możliwie znaczne zwiększenie produkcji L-lizyny. Okazuje się, że L-lizyna może stać się inhibitorem własnej syntezy w zbyt wysokich stężeniach. Nowe metody muszą zatem starać się obejść ten blok. Poza tym, wraz z rosnącą (nadmierną) akumulacją L-lizyny w komórce, wiele mikroorganizmów rozpoczyna jej degradację i wydzielanie. Methylophilus methylotrophus wyróżnia się z tego ogólnego schematu, jako że nie dochodzi u niego do degradacji L-lizyny. Jest ona jednak inhibitorem jednego z enzymów na szlaku jej syntezy.

Bacillus methanolicus

Bacillus methanolicus jest ważnym kandydatem do produkcji aminokwasów z metanolu. Jest bakterią Gram-dodatnią, aerobem i wykazuje wzrost w temperaturze ok. 35-60 st.C, a zatem charakteryzuje się znaczną termotolerancją. Może być izolowany z różnych habitatów, w tym gleby czy wody. Jak na metylotrofa przystało, ma niskie wymagania pokarmowe i wykazuje wzrost na stosunkowo ubogich pożywkach. Co ciekawe, B. methanolicus należy do tych metylotrofów, które nie są zdolne do utylizacji zbyt wielu innych źródeł węgla, co wskazuje, że ich metylotrofia jest elementem ich ekologii.

Podobnie jak Methylophilus methylotrophus, Bacillus methanolicus posiada RuMP, która pomaga w asymilacji C1 po utlenieniu metanolu. Metabolizm wykorzystujący metanol i kolejne powstające związki ma odzwierciedlenie w regulacji ekspresji genów drobnoustroju. Coraz lepiej poznane i bardziej zrozumiałe szlaki przetwarzania metanolu pozwalają na doskonalenie metod hodowli, jak i samego mikroorganizmu. Przykładem może być udane zwiększenie konsumpcji metanolu oraz tolerancji na formaldehyd przez odpowiednią modyfikację Bacillus methanolicus. Sklonowano i scharakteryzowano również geny odpowiedzialne za syntezę L-lizyny, i blisko z nią związaną syntezę kwasu L-glutaminowego. Ponadto stwierdzono, że bakteria wykazuje wzmożoną konsumpcję metanolu, przekładającą się na zwiększoną produkcję aminokwasów, w podwyższonej temperaturze.

Podstawowymi problemami wstrzymującymi wprowadzenie Bacillus methanolicus do bardziej masowej produkcji L-lizyny jest wciąż niedostateczna znajomość genomu tej bakterii oraz niewystarczająco rozwinięta metodyka jej inżynierii genetycznej.

1. Madigan T.M., Martinko M.J., Parker J. Brock Biology of Microorganisms,10th ed.
2. http://en.wikipedia.org/wiki/Methanotroph (z dn. 10.05.2008)
3. http://en.wikipedia.org/wiki/Methane_monooxygenase (z dn. 14. 05.2008)
4. Knapp W.C. et al. Methane monooxygenase gene expression mediated by methanobactin in the presence of mineral copper sources, PNAS 2007. PubMed PNAS
5. http://www.docstoc.com/docs/518893/the-metabolism-of-methylotrophic-bacteria
6. http://www.fz-juelich.de/ibt/ferm/curvers.html
7. Amarjit Dosanjh Why P. Pastoris? http://wwwchem.csustan.edu/chem4400/SJBR/amarjit.htm
8. Zhang W et al. Design of Methanol Feed Control in Pichia pastoris Fermentations Based upon a Growth Model, Biotechnol. Prog., 18 (6), 1392 -1399, 2002.
9. Chang-Chih Chen et al. A Pichia pastoris fermentation strategy for enhancing the heterologous expression of an Escherichia coli phytase, Enzyme and Microbial Technology, Vol 35, 315-320, 2004.
10. Plantz A.B. et al. Pichia pastoris fermentation optimization: energy state and testing a growth-associated model, Appl Microbiol Biotechnol (2006) 72: 297–305.
11. Pichia Fermentation Process Guidelines, Invitrogen life technologies
12. Nobuharu Tsujimoto et al. l-Lysine biosynthetic pathway of Methylophilus methylotrophus and construction of an L-lysine producer, Journal of Biotechnology 124 (2006) 327–337.
13. Kohei ISHIKAWA et al. Disruption of metF Increased L-Lysine Production by Methylophilus methylotrophus from Methanol, Biosci. Biotechnol. Biochem., 72, 70818-1–8, 2008.
14. Trygve Brautaset et al. Bacillus methanolicus: a candidate for industrial production of amino acids from methanol at 50°C, Appl Microbiol Biotechnol (2007) 74:22–34.

Śluzy węglowodanowe występujące w zakażonych syropach cukrowych, fermentujących warzywach i produktach mleczarskich stanowiły przedmiot zainteresowania naukowców już w drugiej połowie XIX w. Już w 1878 r. Centkowski opisał bakterie powodujące śluzowacenie soków w cukrowniach, a w 1910 r. Beijerinck zwrócił uwagę na zdolności Bacillus mesentericus do tworzenia charakterystycznego śluzu. Wtedy, ze względu na chemiczne podobieństwo do dekstryn, nazwano je dekstranami. Dopiero w latach siedemdziesiątych i osiemdziesiątych XX w. określono dokładnie jego budowę. Obecnie uznaje się, że „dekstrany” to wspólna nazwa dla obszernej i zróżnicowanej grupy wielocukrów bakteryjnych zbudowanych z reszt D-glukopiranozy połączonych ze sobą wiązaniami α-1,6-glikozydowymi. Dekstran jest uzyskiwany głównie w wyniku fermentacji sacharozy przez pewne rodzaje bakterii kwasu octowego tj. Leuconostoc i Streptococcus.

Struktura dekstranu, wielkość jeg cząsteczek oraz stopień rozgałęzienia zależą głównie od szczepu bakterii wytwarzającej glukan, a nie od rodzaju czy gatunku, do którego ona należy. Dotychczas opisane dekstrany można umownie zaliczyć do trzech klas:

• klasa I - należy tu większość dekstranów, zbudowane są z łańcucha głównego - α-1,6-glukanowego - do którego poprzez wiązania α-1,2, α-1,3 lub α-1,4-glikozydowe przyłączone są łańcuchy boczne np. dekstran z Leuconostoc mesenteroides B512F - proste łańcuchy zawierają wiązania α-1,6-glikozydowe, natomiast rozgałęzienia rozpoczynają się wiązaniami α-1,3 przyłączonymi do szkieletu głównego i zawierającymi najczęściej pojedynczą cząsteczkę glukozy - 40% (ewentualnie dwie - 45%). Stopień rozgałęzienia to ok. 5 %.

Rysunek 1. Wzór strukturalny fragmentu cząsteczki dekstranu.Źródło

• klasa II - alternan - łańcuch główny z na przemian występującymi wiązaniami α-1,6 i α-1,3 oraz z łańcuchów bocznych przyłączonych wiązaniem α-1,3, np. rozpuszczalny dekstran z Leuconostoc mesenteroides B 1355 - główny łańcuch zawiera ok 54% wiązań typowych i 35% wiązań α-1,3-glikozydowych.

• klasa III - mutany - w łańcuchu głównym występują tylko kolejne wiązania α-1,3-glikozydowe oraz nieliczne α-1,6-glikozydowe np. nierozpuszczalny polisacharyd Sterptococcus mutans 6715, zawierający w łańcuchu głownym ok. 93% reszt glukozowych połączonych wiązaniem α-1,3.

Naturalnie dekstran występuje w płytce nazębnej. Jest także głównym składnikiem Japońskich kryształów, kryształów Tibicos, czy też inaczej kefiru wodnego. Tworzony jest w nich głównie przez probiotyczne Lactobacillus brevis.

Wykorzystujemy dekstrany o różnorodnej wielkości – od 1 do ok. 2000 kDa. Masa cząsteczkowa jest głównym kryterium rozróżnienia frakcji tego polisacharydu i jest definiowana albo przez średnia masę cząsteczkowa Mw , albo średnią liczbową masę cząsteczkową Mn.

Wyjątkowo dogodną metoda charakteryzacji frakcji dekstranu jest rozkład masy cząsteczkowej danej frakcji otrzymywany w wyniku rozdziału chromatograficznego:

Rusunek 2. Rozkład masy cząsteczkowej Dekstranu 10. Źródło

Polimer ten jest bardzo rozciągliwy i giętki. W roztworach wodnych tworzy zwoje o różnych rozmiarach cząsteczek zestawione w poniższej tabeli:

Tabela 1. Promienie Stokesowskie cząsteczek dekstranu.Źródło

• tworzą stabilne jednorodne roztwory w wodzie i elektrolitach, a także w innych rozpuszczalnikach np. siarczek metylu, formamid, glikol etylenowy i glicerol
• nie rozpuszczają się w monohydroksylowych alkoholach np. metanol, etanol, izopropanol, a także większości ketonów tj. aceton, czy 2-propanon
• pH nie wpływa znacząco na rozpuszczalność
• istnieje możliwość otrzymania stężonych roztworów >50% w/v
• w przypadku polisacharydów o niskich masach cząsteczkowych może dojść do powstania mętnych roztworów w czasie ich dłuższego przechowywania, można jednak ten efekt opóźnić przez gotowanie mieszaniny bezpośrednio po przygotowaniu

Filtracja – dość prosta, jednak dla bardziej stężonych roztworów konieczne jest użycie większych filtrów lub ich układów oraz wyższych ciśnień, lub też podniesienie temperatury

Wykazują cechy cieczy newtonowskich, lepkość jest niezależna od pH i stężenia soli, ale zależy od ilości i stosunku między wiązaniami α-1,6; α-1,4 i α-1,3-D-glikozydowymi w dekstranie.

Rysunek 3. Zależność lepkości różnych frakcji dekstranu od ich stężenia w temperaturze 25ºC. Źródło

Jest zależne od wielkości cząsteczek rozpuszczonych, w przypadku dużych cząsteczek takich polimerów nie przechodzą one przez błony z którymi są w kontakcie, co ma duże znaczenie w zastosowaniach tego polimeru.

Rysunek 4. Ciśnienie osmotyczne koloidów dekstranu 40 i 70. Źródło

W postaci proszku mogą być przechowywane przez ok. 5 lat w temperaturze pokojowej. Istotne jest unikanie dostępu wilgoci z powietrza.

W postaci rozpuszczonej można go sterylizować przez autoklawowanie, a następnie przechowywać przez kilka lat w stałej temperaturze. Najdogodniejsze pH dla przechowywania dekstranu w tej formie wynosi ok. 6-7. Dekstrany wykazują dużą stabilność w zakresie pH 4-10.

Dekstran syntetyzowany jest przez α-1,6-transglikozylazy [EC 2.4.1.5, dekstranosacharazy] wydzielane przez komórki bakterii mlekowych, należących głównie do rodzaju Leuconostoc i Streptococcus.

Dekstranosacharaza Leuconostoc jest enzymem indukcyjnym i sacharoza jest jedynym naturalnie występującym induktorem tego enzymu. Dekstranotwórcze mikroorganizmy L. mesenteroides i L. dextranicum można wyizolować ze ześluzowaciałych roztworów cukrowych, warzyw, owoców i produktów mleczarskich oraz soków drzew owocowych.

Rysunek 5. Bakterie Leuconostoc mesenteroides. Źródło

Natomiast bakterie Streptococcus, izolowane przede wszystkim z zębów, jamy ustnej i gardła ssaków, mogą wytwarzać dekstranosacharazę konstytutywnie na różnych źródłach węgla. Jednak w obu przypadkach synteza dekstranu zachodzi tylko w obecności sacharozy.

Rysunek 6. Bakterie Streptococcus mutans. Źródło

Badania nad mikrobiologicznymi źródłami otrzymywania dekstranu i jego przemysłową produkcją rozpoczęto dopiero w latach 1940-1950, gdy dostrzeżono możliwości różnych zastosowań tego polisacharydu. Trudność fermentacji dekstranowej leży w konieczności doboru odpowiednich szczepów produkcyjnych sposród wielu, które różnią się nie tylko wydajnością przeprowadzanego procesu oraz jakością wytwarzanego dekstranu, ale także, a może przede wszystkim wysokimi i bardzo różnorodnymi wymaganiami wzrostowymi poszczególnych szczepów. Organizmem używanym powszechnie w przemysłowej produkcji dekstranu jest Leuconostoc mesenteroides NRRL B12(F) lub Leuconostoc mesenteroides B512. W Rosji używa się szczepu Leuconostoc SP4, a w Czechach i Polsce Leuconostoc L60A. Leuconostoc mesenteroides syntetyzuje dekstran na pożywce, która może zawierać glukozę, inwertowany cukier, maltozę, ekstrakt drożdżowy, namok kukurydziany, namok z kielków słodowych, hydrolizowaną kazeinę, pepton oraz dodatek różnych kationów.

Jest procesem jednoetapowym stosowanym tradycyjnie do produkcji dekstranu z wykorzystaniem bogatych podłóż zawierających do ok. 10% sacharozy jako główne źródło węgla. Jedynym kontrolowanym parametrem tego procesu jest temperatura - 20-25ºC. Podłoże nie jest natleniane, a fermentacja jest prowadzona przez 2 do 6 dni. Wydajnośc tego procesu sięga 45% dla odpowiednio aktywowanych szczepów Leuconostoc mesenteroides. Jednak średnia wydajność wynosi około 25% w przeliczeniu na wyjściową zawartość sacharozy. Otrzymujemy w efekcie natywny dekstran o masie cząsteczkowej z zakresu 50 kDa do 500 MDa.

Polega na wykorzystaniu do syntezy dekstranu preparatu dekstranosacharazy otrzymywanego z Leuconostoc mesenteroides. Metodę tę opracował w 1946 roku Hehre. Proces przebiega w czterech etapach:

1. namnożenie inokulum i produkcja dekstranosacharazy - niska zawratość cukru w podłożu, temp. 25ºC, pH -7 (początkowe pH pożywki wynoszące 6,7-7,2 w miarę upływu czasu hodowli spada do 6,4-6,9; wówczas obserwuje się syntezę dekstranosacharazy, która jest najintensywniejsza w pH 6,7)
2. usuwanie komórek bakterii z podłoża
3. synteza dekstranu - pH - 5,2; 10% sacharozy w podłożu (zawartość sacharozy powinna być większa niż 2%, dlatego podczas hodowli ciągłej stosuje się zasilanie hodowli sacharozą), odpowiednia ilość enzymu
4. frakcjonowanie i oczyszczanie dekstranu.

Optymalny czas trwania takiej hodowli wynosi ok. 24-48 h. Obniżenie temperatury hodowli powoduje spadek syntezy wysokocząsteczkowego dekstranu, a jednocześnie wzrost syntezy dekstranu niskocząsteczkowego. Po zakończeniu hodowli dekstran wytrąca się poprzez dodanie alkoholu metylowego, lub etylowego. Po rozpuszczeniu dekstran poddaje się hydrolizie do wymaganej masy cząsteczkowej, a następnie oczyszcza na wymiennikach jonowych i węglu aktywnym.

Zalety:

• możliwość rozdzielenia fazy produkcji enzymu od fazy fermentacji, przez co proces łatwiej kontrolować
• otrzymany produkt jest bardziej homogenny
• łatwiejsze oczyszczanie
• wydajność ok 28-30%
• może być użyta do syntezy dekstranu klinicznego o określonej, niskiej masie cząsteczkowej

• optymalizacja poszczególnych etapów fermetacji - wpływ temperatury, natlenienia, składu i odczynu podłoża na wydajność sacharazy dekstranowej
• wykorzystanie enzymów o różnym stopniu oczyszczenia
• wykorzystanie immobilizowanej dekstranosacharazy, lub enzymu syntetyzowanego przez immobilizowane bakterie
• korzystanie z mutantów Leuconostoc produkujących desktranosacharazę w sposób konstytutywny
• udoskonalenie kontroli procesu produkcyjnego przez zastosowanie nowoczesnych technik chromatograficznych, zarówno w odniesieniu do rozdziału, jak i określania profilu rozkładu masy cząsteczkowej produktów reakcji enzymatycznej

Cechą charakterystyczną dekstranu jest to, że możliwości jego zastosowania zależą ściśle od jednej konkretnej cechy biopolimeru - czyli od jego masy cząsteczkowej. Również właściwości pochodnych dekstranu zależą znacznie od jego masy. Stąd tez momentem krytycznym dla produkcji dekstranu przemysłowego jest otrzymanie czystych preparatów tego polimeru o kontrolowanej, w wąskim przedziale, masie cząsteczkowej.

Od wielu lat podstawową metodą uzyskiwania dekstranów o określonej, niskiej masie cząsteczkowej jest kosztowny i uciążliwy proces hydrolizy kwasowej połączony z frakcjonowaniem dekstranu natywnego rozpuszczalnikami organicznymi.Po hydrolizie dekstran kliniczny wytrąca się przez dodanie alkoholu etylowego do stężenia 39-46% lub alkoholu metylowego do stężenia 42-50%, a następnie suszy. Dekstran może być również częsciowo depolimeryzowany przy użyciu:

• zasad
• enzymów
• ultradzwięków
• temperatury.

Żadna z tych metod nie została jednak wprowadzona do praktyki przemysłowej i ciągle prowadzi się poszukiwania innych, bardziej efektywnych procesów.

Jedną z propozycji udoskonalenie metody otrzymywania niskocząsteczkowych dekstranów - znajdujących zastosowanie kliniczne - było zastosowanie oczyszczonej dekstranosacharazy w połączeniu z odpowiednimi akceptorami glikozylowymi. Już w latach 50-tych zaobserwowano, że wprowadzenie niektórych cukrów do mieszaniny reakcyjnej zawierającej enzym i sacharozę prowadzi do syntezy oligosacharydów kosztem wysokocząsteczkowego dekstranu. Najbardziej efektywne w tym procesie okazały się maltoza, izomaltoza i dekstrany o niskiej masie. Opisana metoda nie została jednak zastosowana na szeroką skalę, ponieważ pojawiają się znaczne trudności w analizie i oczyszczaniu produktów reakcji, a także występuje koniecznośc użycia drogiego wysoce oczyszczonego enzymu - dekstranosacharaza.

Zaproponowana w latach 90-tych metoda produkcji dekstranu opiera się na wykorzystaniu kultury mieszanej dekstranotwórczych bakterii Leuconostoc mesenteroides oraz drożdży Lipomyces starkeyi rozkładających dekstran. Metoda ta pozwala wykluczyć etap hydrolizy kwasowej, a uzyskiwany produkt niskocząsteczkowy jest bardziej jednorodny niż otrzymywany na drodze tradycyjnej.

• środek zastępujący osocze krwi

Roztwory dekstranu wywierają znaczne ciśnienie osmotyczne dzięki zdolności wiązania wody. Wpływa to na zwiększenie objętości osocza, a tym samym na polepszenie przepływu krwi w naczyniach włosowatych oraz zmniejszenie jej lepkości. Zaletą tego środka krwiozastępczego jest to, że utrzymuje się w organizmie dostatecznie długo, aby spełnić swoją rolę, a jednocześnie nie odkłada się w tkankach w takim stopniu jak inne środki. Ponadto przy jego stosowaniu nie trzeba uwzględniać grupy krwi ani obawiać się zakażeń krwiopochodnych oraz możliwe jest jego długie przechowywanie (w odróżnieniu od krwi). Dekstran do zastępowania osocza powinien mieć masę od 50 kDa do 100 kDa, a stosowany jako regulator przepływu krwi od 20 kDa do 60 kDa. Najpowszechniej stosowany jest dekstran 40 (masa 40 kDa), dekstran 70 oraz dekstran 1 – używany jako hapten przed podaniem dekstranu o wyższej masie, który znacznie zmniejsza częstość występowania niepożądanych reakcji. Otrzymano również produkt stanowiący połączenie dekstranu z hemoglobiną, który można zastosować jako substytut krwi, ponieważ taki kompleks łączy funkcję zamiennika osocza i przenośnika tlenu.

Rysunek 7. Dekstran 40. Źródło

• składnik roztworów stosowanych w krioprezerwacji

Rysunek 8. CryoPur-D™. Źródło

• roztwory do przechowywania organów wykorzystywanych w transplantacji
• składnik implantów – np. stomatologicznych

Przykładem materiału stosowanego do regeneracji ubytków kostnych, w którego skład wchodzi dekstran jest Fisiograft Powder (proszek).

Rysunek 9. Fisiograft Powder. Źródło

• antykoagulant – np. zapobieganie zatorom żylnym

Wykorzystany jest do tego celu siarczan dekstranu. Związek ten wchodzi w reakcje z β-lipoproteinami. Ponadto znalazł on również zastosowanie w różnych metodach analitycznych i preparatywnych, m.in. w oznaczaniu zawartości cholesterolu i innych lipoprotein w surowicy oraz procedurze oczyszczania przeciwciał IgM.

• Sephadex – chromatograficzne oczyszczanie i rozdzielanie białek, polisacharydów oraz kwasów nukleinowych

W reakcji częściowo zhydrolizowanego glukanu i epichlorohydryny liniowe cząsteczki policukrowe dekstranu łączą się ze sobą, tworząc struktury trójwymiarowe. W zależności od warunków procesu liczba wiązań łączących może być różna, co prowadzi do otrzymania preparatu o zróżnicowanym, ściśle określonym stopniu usieciowania. Dzięki temu oraz dużej zawartości polarnych grup wodorotlenowych związki te łatwo chłoną wodę i pęczniejąc tworzą elastyczne żele, które są wykorzystywane w chromatografii jako tzw. sita molekularne.

• standardy mas w sączeniu molekularnym (GPC standards)

Dostępnych jest wiele takich standardów, różniących się masą cząsteczkową zastosowanego dekstranu. Stosowane są pojedynczo lub jako gotowe zestawy kilku z nich (GPC standards kit).

Rysunek 10. GPC standards kit złożony z 10 indywidualnych standardów. Źródło

• dodatek do papieru fotograficznego – polepsza jakość emulsji srebra
• używany do drukowania tkanin (przemysł tekstylny)

Rysunek 11. Przykładowy wzór geometryczny na tkaninach drukowanych. Źródło

• surowiec przy wyrobie tabletek i kapsułek
• środek do leczenia trudno gojących się ran

Przykładem takiego produktu jest puder leczniczy Acudex. Jest to kopolimer dekstranu, którego działanie polega na zdolności do wchłaniania płynów. Stosowany na uszkodzoną skórę wchłania wydzielinę ropną w wyniku czego przyspiesza oczyszczenie ran. Wykorzystuje się go do leczenia np. zakażonych ran pooparzeniowych, zakażonych ran pooperacyjnych i pourazowych, odleżyn oraz owrzodzeń.

Rysunek 12. Zasypka Acudex. Źródło

• składnik kropli do oczu

Przykładowym produktem jest Tears Naturale II zawierający układ polimerowy rozpuszczalny w wodzie (0,1% dekstran i 0,3% hypromeloza), który wspomaga i zastępuje działanie nawilżające i poślizgowe łez. Umożliwia on utworzenie warstwy ochronnej przylegającej do powierzchni rogówki, współdziałając z obecnymi w oku składnikami łez.

Rysunek 13. Krople Tears Naturale II. Źródło

• nośnik dla leków i szczepionek – zabezpieczenie przed szybką eliminacją z organizmu co podnosi skuteczność działania oraz tym samym umożliwia zmniejszenie dawki, np. dekstran z insuliną
• lek na ostre zatrucia metalami ciężkimi

Stosowany jest merkaptodekstran (siarkodekstran), który powstaje podczas działania tiooctanu na dekstran. Wykazuje duże powinowactwo do jonów metali ciężkich, m.in. złota, srebra, rtęci i miedzi, przy stosunkowo niskiej toksyczności.

• zagęstnik – dzięki czemu można uzyskać półstałą konsystencję produktów

Zastosowanie dekstranu zapobiega krystalizacji cukru, poprawia utrzymanie wilgoci, smaku oraz wyglądu różnych artykułów spożywczych. Jest on stosowany jako zagęstnik np. w lodach oraz w dżemach.

• biodegradowalny składnik opakowań do żywności

• składnik pudrów, pomadek i kremów

Przykładowym produktem kosmetycznym jest Vichy Thermal Fix – odświeżający hydrożel pod oczy zmniejszający obrzęki. Zastosowany w nim siarczan dekstranu zmniejsza zastój limfy i likwiduje obrzęk powiek.

Rysunek 14. Krem Thermal Fix Yeux. Źródło

• Dekstran i dekstranazy - źródła mikrobiologiczne, właściwości i zastosowanie, M.Pleszczyńska Zakład Mikrobiologii Przemysłowej,UMCS Lublin, Biotechnologia 1999
• Technologia biochemiczna, Krzysztof W. Szewczyk, Oficyna Wydawnicza Politechniki Warszawskiej,Warszawa 2003
• Biotechnologia żywności, praca zbiorowa pod redakcją W. Bednarskiego i A. Repsa, Wydawnictwo Naukowo - Techniczne Warszawa, 2003
• http://www.dextran.net/dextran-physical-properties.html