Streptomyces to Gram-dodatnie bakterie tlenowe, których naturalnym miejscem występowania jest gleba i woda. Charakterystyczną ich cechą jest budowa, która przypomina budowę grzybów strzępkowych. Podobnie jak one posiadają budowę nitkowatą. Jej strzępki mogą być rozgałęzione i tworzyć tzw. pseudomycelium (pseudogrzybnie), które może być powierzchniowe, wgłębne lub powietrzne. Strzępki Streptomyces są jednak mniejsze i mniej zróżnicowane morfologicznie od grzybów. Tworzą filamenty o średnicy 0,5-1 μm i nieograniczonej długości często pozbawionej ścian poprzecznych w fazie wegetatywnej. Ich wzrost następuje na końcach filamentu i często prowadzi do rozgałęzienia filamentu.

Różne formy tworzone przez Streptomyces

Do tego rodzaju zaliczamy ponad 500 gatunków, z których do najliczniejszych należą:

• S. achromogenes

• S. avermitilis

• S. coelicolor

• S. felleus

• S. ferralitis

• S. cinnamonensis

• S. filamentosus

• S. griseus

• S. hygroscopicus

• S. iysosuperficus

• S. somaliensis

• S. scabies

• S. thermoviolaceus

• S. violaceoruber

Genomy wielu szczepów Streptomyces (np. S. coelicolor, S. avermitilis,) zostały w ostatnich latach zsekwencjonowane. Każdy z nich ma formę liniowych chromosomów w przeciwieństwie do genomów większości bakterii, które przybierają formę kolistą. Ponadto rodzaj ten cechuje się wysoką zawartością cytozyny i guaniny w łańcuchu DNA (69-73%)

W ostatnich latach w badaniach biotechnologicznych coraz częściej używa się szczepów Streptomyces do produkcji rekombinowanych białek ludzkich. Zaczynają one zastępować w laboratoriach dobrze poznane i łatwe w wykorzystaniu, lecz ciągle niedoskonałe szczepy Escherichia coli. Problem z E. coli polega przede wszystkim na braku lub nieprawidłowej glikozylacji białek, a także na nieprawidłowym procesie zwijania białek co w konsekwencji prowadzi do powstania niefunkcjonalnych produktów. Szczepy Streptomyces natomiast, mają zdolność do sekrecji prawidłowo zwiniętych białek do medium w prostym procesie oczyszczania. Te cechy sprawiają, że są one atrakcyjną alternatywą dla takich modelowych organizmów jak E. coli czy B. subtilis.

Bardzo charakterystyczną cechą Streptomyces są produkty wtórne metabolizmu. Produkują one ponad dwie trzecie używanych obecnie w medycynie antybiotyków. Mogą syntetyzować również: pestycydy, insektycydy, fungicydy oraz związki przeciwwirusowe. Ponadto rzadko są one patogenami. Do nielicznych przykładów chorób wywoływanych przez gatunki z rodzaju Streptomyces (S. somaliensis oraz S. sudanensis) należy mycetoma (stopa madurska) - zakaźna choroba skóry i tkanki podskórnej, przebiegająca niekiedy z zajęciem mięśni, kości i sąsiadujących narządów. Choroba ta przebiega z przewlekłym obrzękiem, guzowatymi naciekami oraz obecnością licznych przetok, prowadzących do rozległych zniekształceń.

Zdjęcie kończyny pacjenta chorego na mycetoma

Streptomyces są producentami wielu niezwykle ważnych związków chemicznych wykorzystywanych w różnych dziedzinach naszego życia, a przed wszystkim w medycynie. Jednak najważniejszą klasą związków użytecznych dla człowieka wytwarzanych przez ten rodzaj są antybiotyki. Jak widać rząd Actinomycetes (do którego należą Streptomyces) dominują w świecie żywym w ilości wytwarzanych antybiotyków.

Porównanie produkcji różnych związków przez Actinomycetes w stosunku do innych bakterii i grzybów

Produkcja antybiotyków u Streptomyces jest niezwykle skomplikowana i silnie regulowana. Nie są one wytwarzane przez młode kolonie, które mają dostęp do składników pokarmowych ( łatwo dostępne źródła węgla, azotu oraz fosforu hamują syntezę antybiotyków). Najczęściej produkcja indukowana jest przez sygnał głodu, gdy z grzybni substratowej pojawiają się napowietrzne strzępki. W 1979 roku Keith Chater i Mike Merrick wysunęli hipotezę, że antybiotyki nie są wytwarzane w celach atakowania innych mikroorganizmów, lecz ochrony źródeł pokarmu. Być może jest to pułapka dla mikroorganizmów posiadających zdolność aktywnego poruszania się, które zwabione pokarmem zostają zniszczone przez antybiotyki i same stają się źródłem pożywienia dla koloni Streptomyces. Wielka różnorodność antybiotyków może wynikać z rywalizacji między gatunkami Streptomyces o niszę ekologiczną (im większą liczba antybiotyków tym więcej potencjalnych celów), które posiadają ogromną liczbę genów odporności na nie, co spowodowała presje selekcyjną na wytwarzanie nowych odmian.

Nie będzie tutaj szczegółowo omawiana biosynteza antybiotyków, poniższy przykład ma tylko uświadomić szaloną złożoność procesu, zaangażowanie w niego ogromnej liczby enzymów oraz częstą niemożność odtworzenia go przez syntezę chemiczną. Głównym substratem do wytwarzania streptomycyny jest glukoza, z której syntetyzowane są trzy główne prekursory tego antybiotyku: dTDP-L-dihydroksystreptoza, NDP-N-metylo-L-glukozoamina oraz 6P-streptydyna. Streptomycyna jest wytwarzana w postaci nieaktywnej (6P-streptomycyna), a dopiero gdy jest uwalniana do środowiska reszta fosforanu jest usuwana, co aktywuje antybiotyk.

Schemat 1. Biosynteza streptomycyny

Poznanie regulacji biosyntezy antybiotyków było bardzo ważne dla przemysłu farmaceutycznego. Niestety nie jest ona do końca dobrze zbadana, ale wiadomo że geny biosyntezy są zorganizowane w tzw. „cluster” i ulegają wspólnej regulacji. W kontrolę są zaangażowane hormony bakteryjne (quorum-sensing molecules), a głównie czynnik A pierwotnie odnaleziony u Streptomyces griseus (obecnie wiemy że występuje u większości Streptomyces). Znosi on represję genów biosyntezy antybiotyków i powoduje rozpoczęcie ich syntezy.

Schemat 2. Kaskada regulacji syntezy streptomycyny

Czynnik A z Streptomyces griseus

Wyszukiwanie nowych użytecznych antybiotyków to ogromna gałąź przemysłu farmaceutycznego. Dawniej największym potencjalnym źródłem nowych szczepów Streptomyces była ziemia. Naukowcy izolowali próbki z wielu nietypowych miejsc jak na przykład Hamao Umezawa, który odkrył kasugamycynę z ziemi ze świątyni Kasuga założonej w 768 r. przez klan Fujiwara w Nara. Materiał badawczy był następnie wytrząsany z wodą i filtrowany. Z tak uzyskanych próbek przygotowano seryjne rozcieńczenia, które wysiewano na płytki agarowe. Pierwotnie dokonywano selekcji wyrosłych koloni na podstawie cech morfologicznych, aktualnie istnieją zautomatyzowane systemy komputerowe wspomagające wyszukiwanie nowych szczepów. Najczęściej używano medium hodowlanego z chityną lub kwasem propionowym jako głównym źródłem węgla, ponieważ jest doskonałe pokarm dla większości Streptomyces,, a jednocześnie hamuje wzrost innych mikroorganizmów. Dodawano też środków przeciwgrzybicznych by jeszcze bardziej wypromować wzrost Streptomyces.Często stosowaną praktyką jest też przechowywanie próbki ziemi w bardzo suchym środowisku(celowe przesuszanie), co powoduje wyginięcie większości mikroorganizmów, przetrwają jedynie spory Streptomyces. Skład pożywek selekcyjnych z czasem stawał się co raz bardziej skomplikowany, dla przykładu w Japonii zaczęto dodawać glinkę o nazwie Kanumatsuchi, która używana jest przy drzewkach bonsai by zahamować jego wzrost(glinka silnie absorbuje fosforany). Powodowało to indukowanie sygnału głodu i wytwarzanie antybiotyków normalnie nie pojawiających się. By sprawdzić czy uzyskana czysta kultura wykazuje jakieś właściwości bakteriobójcze wykonywano proste doświadczenie polegające na wysianiu kilku róznych mikroorganizmów na jednej szalce,a pod kątem prostym do nich badany szczep(zdjęcie pochodzi z prac pioniera badań nad Streptomyces).

Pierwsze testy podatności na antybiotyki (zdjęcie pochodzi z Waksman, S. A. [1950] „The Actinomycetes: their nature, occurrence and importance” Waltham MA: Chronica Botanica Co.)

Aktualnie w wyszukiwaniu nowych antybiotyków przoduje jednak nieukierunkowana mutageneza znanych szczepów oraz chemiczne modyfikacje już istniejących.

Chlorotetracyklina (aureomycyna) antybiotyk z grupy tetracyklin stosowany głównie miejscowo w zakażeniach ropnych skóry, w zakażeniach spojówek i rogówki jako środek odkażający, wytwarzana przez Streptomyces aureofaciens, hamuje syntezę białek bakteryjnychb(uniemożliwia przyłączanie się tRNA do mRNA) stabilny przy odczynie kwaśnym (zasadowe środowisko rozkłada chlorotetracyklinę), okres półtrwania w krążeniu wynosi 6-11 h.

Chloramfenikol (chloromycetyna, detreomycyna) w 1947 roku wyizolowany przez John Ehrlich, Paul Burkholder i David Gotlieb z Streptomyces venezuelae, obecnie uzyskiwany syntetycznie (od 1950 roku), łatwo i szybko ulega wchłonięciu z jelit do krwi (w ciągu 1,5 h), okres półtrwaniaw krążeniu 5 h, przechodzi do mleka matki i przez barierę łożyskową, trudno rozpuszczalny w wodzi, smak gorzki (stosuje się estry pozbawione tego smaku), toksyczny- uszkadza głównie szpik kostny (wywołuje wówczas anemię aplastyczną), wykazuje właściwości immunosupresyjne Mechanizm działania polega na hamowaniu syntezy białek bakteryjnych poprzez:

• wiązanie się z podjednostką 50S rybosmu
• blokowaniu peptydotransferazy
• uniemożliwianie uwalniania sie zsyntetyzowanego oligopeptydu z kompleksu z rybosomom

Erytromycyna jest to antybiotyk makrolidowy wytwarzany przez Streptomyces erythreus, wyizolowany w 1952 roku przez zespół J. M. McGuire, hamuje syntezę białka poprzez wiązanie tRNA, spektrum działania podobne do penicyliny (używana u osób uczulonych na penicylinę) łatwo przenika z jelit do krwi, przechodzi do mleka matki i przez barierę łożyskową, okres półtrwania w krążeniu wynosi 1,5 h.

Streptomycyna - antybiotyk aminoglikozydowy, wąski zakres działania na niektóre bakterie Gram-ujemne (np. na prątka gruźlicy), wyizolowana z Streptomyces griseus w 1943 r. przez doktoranta Alberta Schatza pracującego w laboratorium Selmana Waksmana(laureat nagrody nobla z 1952 roku, za odkrycie streptomycny - pierwszego efektywnego antybiotyku przeciw gruźlicy), obecnie został zarezerwowany wyłącznie do leczenia gruźlicy( istnieje niewiele leków aktywnych wobec gruźlicy - powszechne stosowanie streptomycyny w celu leczenia innych zakażeń mogłoby doprowadzić do uodpornienia się prątków gruźlicy), silnie toksyczny(może wywoływać zaburzenia słuchu i równowagi; ponadto obserwowano: zapalenie nerwu wzrokowego, zaburzenia widzenia, reakcje uczuleniowe )

Neomycyna antybiotyk aminoglikozydowy produkowany przez Streptomyces fradiae. głównie stosowany zewnętrznie, nie wchłania się z przewodu pokarmowego, toksyczny, wiąże się nieodwracalnie z miejscem A rybosomu uniemożliwiając bakterii włączanie nowych aminokwasów do powstającego białka, odkryty przez Selmana Waksmana w 1949 r., okres półtrwania w krążeniu wynosi 2-3 h.

Kanamycyna antybiotyk aminoglikozydowy izolowana z Streptomyces kanamyceticus, okres półtrwania w krążeniu wynosi 2-3 h, ze względu na wysoką toksyczność używany zewnętrznie lub ostatecznie dożylnie gdy zawiodą inne metdoy leczenia

W ostatnich lata zmniejszyła się liczba nowych antybiotyków wprowadzanych do użytku handlowego. Wynika to z zmniejszającej się liczby nowo odkrywanych gatunków Streptomyces, mało doskonałych metod selekcji nowych szczepów i niemożności ekstrakcji rzadkich antybiotyków. W latach 90-tych nastawiano się głównie na chemiczną modyfikację istniejących leków, lecz jej możliwości są także ograniczone i trzeba wymyślać nowe sztuczki. Jedną z ciekawszych są antybiotyki hybrydowe, których powstawanie ilustruje poniższy schemat:

Tworzenie antybiotyków hybrydowych

Kolejnym pomysłem jest dodawanie genów z innych organizmów metodami inżynierii genetycznej, które zwiększają ilość produkowanych antybiotyków, ułatwiają indukcję produkcji itp. Ogromne sukcesy w wyszukiwaniu związków o potencjalnych właściwościach bakteriobójczych dało sekwencjonowanie genomów Streptomyces.

http://en.wikipedia.org/wiki/

http://luskiewnik.strefa.pl/antybiotyki/

http://streptomyces.org.uk/

David A. Hopwood „Streptomyces in Nature and Medicine: The Antibiotic Makers” Oxford University Press 2007

Kurdlan to mikrobiologiczny egzopolisacharyd, zewnątrzkomórkowy polimer o charakterze obojętnego homoglukanu, w którym kolejne reszty D-glukopiranozy połączone są wiązaniami β-(1→3)-O-glikozydowymi. Wiązanie to determinuje strukturę polimeru.

Rysunek 1. Podstawowa struktura kurdlanu – dwie cząsteczki D-glukopiranozy połączone wiązaniem β-(1→3)-O-glikozydowym.

Wodne roztwory zawiesiny kurdlanu (kurdlan jest nierozpuszczalny w wodzie!) posiadają unikatową możliwość tworzenia trwałych żeli pod wpływem podwyższonej temperatury, które przy dalszym podgrzewaniu nie topią się. Żele te są stabilne w szerokim zakresie pH (od 3 do 9,5) oraz temperatury (od 140 do 160°C).

Prekursorem badań nad budową, i właściwościami kurdlanu był Tokuya Harada z Uniwersytetu w Osace. On również nadał nazwę temu polisacharydowi oraz jako pierwszy wyizolował oryginalny szczep bakteryjny wytwarzający kurdlan.

Wspomniany pan Harada zajmował się skriningiem bakterii glebowych degradujących różne frakcje substancji ropopochodnych. Jeden z badanych szczepów wytwarzał interesujący polimer. Szczep ten został sklasyfikowany jako Alcaligenes faecalis var Myxogenes. Wyizolowany szczep został udoskonalony i w toku mutagenizacji uzyskano szczep produkujący kurdlan z wydajnością odpowiednią dla przemysłowej biosyntezy. Alcaligenes faecalis to Gram-ujemna, ruchliwa proteobakteria w kształcie pałeczki. Jest obligatoryjnym aerobem, może wykorzystywać 10% glikol etylenowy jako źródło węgla. Została nazwana ze względu na pierwsze odkrycie w kale ale okazała się być powszechna również w glebie, wodzie i środowiskach związanych z ludźmi. Optymalny wzrost występuje w około 37 ° C. Chociaż powoduje zakażenia oportunistyczne, jest ogólnie uważana za niechorobotwórczą. Oprócz produkcji kurdlanu A. faecalis jest wykorzystywany na do produkcji niestandardowych aminokwasów.

Rysunek 2. Alcaligenes faecalis pod mikroskopem i na szalce.

Dziś wiadomo, że zdolność produkcji kurdlanu posiada także rodzaj Agrobacterium.

Fizjologiczna rola kurdlanu nie została jasno sformuowana. Można przypuszczać, że pełni ona funkcję ochronną przed szkodliwymi związkami znajdującymi się m.in. we frakcjach ropy naftowej. Może również stanowić rezerwę pokarmową w razie niedoboru innych źródeł węgla.

Metaboliczne szlaki biosyntezy kurdlanu nie są całkowicie poznane, jednak przyjmuje się, że główną drogą wytwarzania kurdlanu jest bezpośrednia synteza polisacharydu z glukozy (przez UDP-glukozę) pochodzącej z podłoża hodowlanego, podobnie jak ma to miejsce w procesie syntezy celulozy przez bakterie. Ponadto badania spektroskopowe wykazały przesunięcie węgla 13ºC w pierścieniu znakowanej radioizotopowo glukozy sugerując istnienie pobocznej drogi biosyntezy kurdlanu z glukozy resyntetyzowanej z pośrednich produktów glikolizy, cyklu pentozowego oraz szlaku Entnera-Doudoroffa. Ilościowa relacja produkcji kurdlanu na drodze bezpośredniej syntezy z glukozy (droga główna) do produkcji drogą poboczną (z intermediatów) może się zmieniać w zależności od warunków hodowli.

Uważa się, że w biosyntezie łańcucha glukanowego kurdlanu ważną rolę odgrywa dolichol. Tak jak w posttranslacyjnej glikozylacji białek oraz w biosyntezie niektórych składników bakteryjnych ścian komórkowych (m.in. peptydoglikanu i kwasów tejchojowych) dolichol jest akceptorem kolejnych reszt cukrowych, w tym przypadku glukopiranozowych, przenoszonych z UDPGlc.

Zapoczątkowanie biosyntezy kurdlanu wymaga zużycia trzech cząsteczek ATP, natomiast przyłączenie każdej kolejnej reszty do rosnącego łańcucha jest związane z hydrolizą 2 ATP. Co ważne, współzawodnictwo o cząsteczki dolicholu wyżej wspomnianych szlaków syntezy z drogą biosyntezy kurdlanu jest niewielkie, ponieważ maksymalna produkcja kurdlanu (przeciwnie do innych zewnątrzkomórkowych polisacharydów) ma miejsce w fazie stacjonarnej, po zastopowaniu wzrostu drobnoustroju (spowodowanym głównie wyczerpaniem źródła azotu). Praktycznie więc, nie obserwuje się konkurencji. Prawdopodobnie dolichol bierze również udział w sekrecji kurdlanu z komórki.

Rysunek 3. Szlak biosyntezy kurdlanu.

Strukturę kudlanu obrazuje poniższy rysunek:

Rysunek 4. Kurdlan jest homopolimerem glukozy, w którym podjednostki połączone są wiązaniami β-(1→3)-O-glikozydowymi.

W alkalicznych roztworach kurdlan jest całkowicie rozpuszczalny, a jego cząsteczki przyjmują konformacje przypadkowego zwoju. Przy neutralizacji pH polimer zaczyna przechodzić w stan uporządkowany- cząsteczki zwijają się helikalnie i występują w postaci pojedynczych lub potrójnych łańcuchów, w których na jeden skręt helisy przypada siedem reszt glukozowych. W tych warunkach zaczyna powstawać rzadki, lepki żel. Ogrzanie zawiesiny kurdlanu powyżej 90°C, a następnie powolne jej schłodzenie powoduje częściową utratę wody i powstanie nowej, ściślejszej struktury potrójnej helisy , w której długość pojedynczego skrętu zmniejsza się z 22,6 do 12,1Å, a średnica wynosi 15,16 Å. Strukturę tę tworzoną przez symetrycznie zwinięte i przesunięte w fazie trzy łańcuchy glukanowe, makroskopowo obserwujemy jako trwały, mocny żel. Usunięcie z niej reszty wody powoduje jeszcze bardziej ścisłe upakowanie łańcuchów i zmniejszenie się długości jednego skrętu helisy do 5,7 Å. Możliwe, że potrójne helisy tworzą między sobą sieć wiązań wodorowych. Podczas ogrzewania zawiesin kurdlanu jego mikrofibrylle ulegają asocjacji powodując powstanie żelu, który jest najtrwalszy w pH równym 3. W zakresie temperatur 55-90 °C w asocjacji podstawową rolę odgrywają międzycząsteczkowe wiązania wodorowe, a powyżej tej temperatury zaczynają przeważać oddziaływanie hydrofobowe między mikrofibryllami. W temperaturze powyżej 120°C włókna przyjmują strukturę jeszcze bardziej uporządkowana, jednak nie wiadomo wciąż jakie zachodzą wtedy zmiany w strukturze polimeru.

Rysunek 5. Cząsteczkowe modele potrójnej helisy kurdlanu na podstawie koordynatów uzyskanych metodą dyfrakcji promieni rentgenowskich.

Niektórzy badacze sugerują że kurdlan jest wytwarzany przez drobnoustroje w postaci granul o strukturze mikroskopowej podobnej do granul skrobi. W granulach tych łańcuchy polisacharydu występują w mało uporządkowanej formie.

Rysunek 6. Kurdlan. a) model helikalnej struktury cząsteczki kurdlanu. b) i c) zmiany w konformacji molekuły pod wpływem ogrzewania i suszenia.

Stężenie, pH (bardziej zasadowe niż 0,2 N NaOH) oraz jony metali powodują zmianę rozpuszczalności (zależy ona także od stopnia polimeryzacji łańcuchów) i konformacji cząsteczek kurdlanu. Z kolei ze wzrostem temperatury rośnie przezroczystość zawiesiny kurdlanu. Żel kurdlanowy jest bardzo elastyczny, trwały i nierozpuszczalny do temperatury 140-160°C, a więc nie topi się po ponownym ogrzaniu

Rysunek 7. Obrazy mikroskopowe (powiększenie 100 000x) struktury żelu kurdlanu. (A) - Mikorfibrylle (100 Å w średnicy) są zasocjowane i zoorganizowane w strukturę żelu. (B) Mikrofibrylle nie są zasocjowane. (C) Mikrofibrylle nie zasocjowane i o mniejszej śrenicy - 50 Å.

Rysunek 8. Schemat przykładowej procedury izolacji kurdlanu.

Główne zastosowania kurdlanu wynikają wprost z jego unikalnych cech. Już krótko po odkryciu planowym zastosowaniem kurdlanu stało się użycie go głównie w przemyśle spożywczym jako substytutu naturalnych polisacharydów roślinnych oraz preparatu zagęszczającego (żelifikującego). Ze względu na obecność wiązań β-(1→3)-glikozydowych które nie są hydrolizowane przez enzymy trawienne człowieka kurdlan charakteryzuje się niską wartością kaloryczną co sugeruje możliwe jego wykorzystanie w produktach dietetycznych. Z kolei tworzenie przez kurdlan żeli odpornych na zamrzanie oraz zdolnych do wchłaniania dużej ilości cukrów sugeruje możliwość wykorzystania tego polimeru w produkcji lodów, mrożonek i wyrobów cukierniczych. Może on być wykorzystywany także w produkcji zup oraz deserów, ponieważ jest dodatkiem nadającym płynom pseudoplastyczny charakter, zagęszczającym oraz stabilizującym żywność. Kurdlan został dopuszczony do stosowania w przemyśle spożywczym w Japonii, gdzie stanowi składnik różnych pokarmów (głównie cukierniczych), ale na razie nie jest akceptowany jako składnik żywności w USA i Unii Europejskiej. Kurdlan wykorzystywany jest również przy tworzeniu biodegradowalnych i nierozpuszczalnych w wodzie błon.

Rysunek 9. Niektóre japońskie produkty zawierające kurdlan.

Prawdopodobnie najwcześniej kurdlan zostanie wykorzystany w innych gałęziach przemysłu np. do odzysku odpadowych olejów, substytut agaru i agarozy lub do immobilizacji enzymów. Interesujące także wydają się być doniesienia o antynowotworowych właściwościach kurdlanu…

http://www.lsbu.ac.uk/water/hycurdlan.html,

http://en.wikipedia.org/wiki/,

http://www.botany.utexas.edu/facstaff/facpages/mbrown/ongres/icheese.htm,

http://www.inchem.org/documents/jecfa/jecmono/v44jec04.htm,

http://www.imakenews.com/pureaircontrols/index000108927.cfm,

http://www.microbelibrary.org/ASMOnly/details.asp?id=2287&Lang=,

Kurdlan – struktura, właściwości, wykorzystanie. Marianna Turkiewicz, Wojciech Czub, Biotechnologia nr 3 (38), 1997.