Gatunki Bacillus należą do najpopularniejszych źródeł enzymów zewnątrzkomórkowych. Wynika to z faktu iż stosunkowo łatwo je pozyskać i prowadzić hodowlę. Ponadto jest to bardzo zróżnicowana grupa, występują w niej zarówno gatunki psychrofilne, mezofile, termofilne (a więc możliwe do hodowli w różnych warunkach temperaturowych w zależności od potrzeb i możliwości), charakteryzujące się różną wrażliwością na warunki pH i zasolenie, a co za tym idzie, można z nich pozyskać enzymy ekstremalne tj. charakteryzujące się np. odpornością na wysoką temperaturę.

Ryc. 1 Bacillus subtilis

Enzymy zewnątrzkomórkowe produkowane przez Bacillus to głównie białka związane z przebudową peptydoglikanu, z procesem sporulacji (syntetyzowane, gdy bakteria przygotowuje się to wytworzenia spor), a także produkcją enzymów o charakterze obronnym jak np. penicylazy. Enzymy dokonujące autolizy ściany komórkowej są niezwykle istotnie z punktu widzenia bakterii, sprawiają one, iż peptydoglikan staje się tworem dynamicznym, co jest niezbędne przy procesach wzrostu mikroorganizmu, podziału komórkowego, jak i przy transformacji. Punktu widzenia hodowli, bardzo ważnym jest w którym momencie rozwoju hodowli wydzielane są konkretne, poszukiwane przez nas enzymy. I tak zaobserwowano, iż podczas fazy lag oraz logarytmicznego wzrostu, synteza enzymów zewnątrzkomórkowych jest niewielka, a ich maksymalna synteza zachodzi przed sporulacją, pod koniec fazy eksponencjalnej i na początku fazy stacjonarnej wzrostu bakterii. Na wydajność produkcji enzymów oraz etap w którym są syntetyzowane, znaczny wpływ może mieć skład medium hodowlanego, wobec czego należy go dobierać pod kątem pożądanego przez nas produktu. Przykładowo produkowana przez Bacillus subtilis α - amylaza jest syntetyzowana zgodnie zaproponowanym schematem, gdy rośnie na bogatej pożywce, natomiast kiedy kultura bakterii rośnie na pożywce minimalnej, zawierającej skrobię jako główne źródło węgla, to bakterie wydzielają pewne ilości α -amylazy również podczas fazy wzrostu eksponencjalnego. Podobnie zachowują się proteazy, nukleazy oraz enzymy związane z hydrolizą ściany komórkowej. Do syntezy niektórych musimy dostarczyć bakteriom odpowiedni induktor. Uważa się, iż synteza egzoenzymów w określonych etapach rozwoju hodowli jest związana z powszechnym zjawiskiem, jakim jest represja kataboliczna. Określona natura wydzielania enzymów zewnątrzkomórkowych przez bakterie z grupy Bacillus może być przyczyną utrudnień jeżeli stosujemy hodowlę ciągłą, co w praktyce sprowadza się do utrzymywania kultury w fazie wzrostu eksponencjalnego. Należy się także liczyć z faktem, iż produkcja enzymu będzie zmienna w czasie - wydajność znacznie spada po rozcieńczeniu kultury. Problem ten można częściowo zniwelować stosując wielopoziomowy, ciągły układ hodowli.

Pozyskanie enzymów zewnątrzkomórkowych z hodowli jest stosunkowo łatwe, jako że bakterie wydzielają je na zewnątrz komórki (egzoenzymy) bądź do medium hodowlanego, w związku z czym sprowadza się to do zebrania supernatantu znad zwirowanej uprzednio hodowli, oraz oczyszczenia pożądanych enzymów.

Wyróżniamy następujące enzymy zewnątrzkomórkowe produkowane przez poszczególne gatunki Bacillus:

• α-Amylaza (B. amyloliquefaciens, B. caldolyticus, B. coagulans, B. licheniformis, B. macerans, B. stearothermophilus, B. subtilis, B. subtilis var. amylosacchariticus, alkalofilne Bacillus spp.)
• β-Amylaza (B. cereus, B. megaterium, B. polymyxa, alkalofilne Bacillus spp.)
• Celulaza (B. brevis, B. firmus, B. polymyxa, B. pumilus, B. subtilis, B. circulans)
• Arabinaza (B. subtilis)
• Chitynaza (B. circulans)
• Dekstranaza (B. megaterium, B. subtilis)
• Galaktanaza (B. amyloliquefaciens, B. subtilis var. amylosaccharitieus)
• β-1,3-glukanaza (B. circulans, B. polymyxa, B. subtilis, Alkalofilne Bacillus sp.)
• β-1,6-glukanaza (B. circulans)
• Izoamylaza (B. amyloliquefaciens, B. polymyxa)
• Maltaza (B. subtilis)
• Mannaza (B. amyloliquefaciens)
• Pektynaza (B. circulans, B. polymyxa, B. pumilus, B. sphaericus, B. stearothermophilus, B. subtilis, alkalofilne Bacillus spp.)
• Fosfomannaza (B. circulans)
• Pullulanaza (Alkalofilne Bacillus sp.)
• Ksylanaza (B. amyloliquefaciens, B. firmus, B. polymyxa, B. subtilus, B. subtilis var. amylosacchariticus)
• Licheanaza (B. pumilus)
• DNAza/RNAza (B. amyloliquefaciens, B. cereus, B. pumilus, B. subtilis)
• Alkalofilna proteaza (alkalofilne Bacillus spp.)
• Aminopeptydaza (B. licheniformis, B. subtilis)
• Esteraza (B. subtilis)
• Halofilna proteaza (Bacillus sp.)
• Metaloproteinazy (B. amyloliquefaciens, B. cereus, B. licheniformis, B. megaterium, B. polymyxa, B. subtilis,, B. subtilis var. amylosacchariticus, B. thermoproteolyticus, B. thuringiensis)
• Proteinazy serynowe (B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, B. pumilus, B. subtilis, B. subtilis var. amylosacchariticus)
• Seryno-metaloproteinazy (B. licheniformis, B. pumilus)
• β - laktamaza (B. anthracis, B. cereus, B. licheniformis, B. megaterium, B. subtilis)
• Amidazy penicylinowe (B. megaterium)
• Alkaliczna fosfataza (B. amyloliquefaciens, B. cereus, B. subtilis, alkalofilne Bacillus sp.)
• Lipaza (B. licheniformis)
• Fosfolipaza C (B. anthracis, B. cereus, B. thuringiensis)
• Tiaminaza (B. thiaminolyticus)
• Enzymy bakteriolityczne (B. licheniformis, B. subtilis)

Jak widać liczba produkowanych enzymów jest bardzo duża i można powiedzieć obejmuje szeroki przekrój specyficzności, zarówno substratowych jak i względem katalizowanych reakcji.

α-Amylaza jest karbohydrazą enzymem hydrolizującym wiązanie α-1,4 - glikozydowe polisacharydów. Znalazła szerokie zastosowanie w przemyśle, przykładowo w gałęzi produktów tekstylnych, gdzie stosuje się ją razem z innymi karbohydrazami do usuwania środków impregnujących włókna, z kolei w browarnictwie i gorzelnictwie ułatwia produkcję brzeczki. Przemysł spożywczy również korzysta z jej usług przy przetwórstwie skrobi, produkcji syropów glukozowych, klarowaniu soków, a także degradacji skrobi w piekarnictwie w celu poprawienia właściwości chleba i opóźnienia czerstwienia. Może stanowić dodatek do detergentów, jak i preparatów ułatwiających trawienie.

β-Amylaza oczywiście również posiada aktywność karbohydrazy, hydrolizuje jednak (wbrew swojej nazwie) wiązanie α-1,4 - glikozydowe polisacharydów. Jest jednak (w przeciwieństwie do poprzednio wzmiankowanego enzymu) egzo- amylazą. Znalazła powszechne zastosowanie m. in. w cukiernictwie do produkcji syropów lub w browarnictwie przy warzeniu, w celu zwiększenia wykorzystania składników brzeczki.

Kolejnym enzymem jest celulaza hydrolizująca wiązania β-1,4-glikozydowe, dzięki czemu rozkłada celulozę do celobiozy. Wykorzystuje się ją przy doskonaleniu tkanin poprzez kontrolowaną hydrolizę włókien celulozowych, a także razem z amylazami służy przy usuwaniu materiałów impregnujących tkaniny. W przemyśle piekarskim można jej używać, aby poprawić wyrabialność ciasta i zwiększyć objętość bochenków. Znalazła także zastosowanie w przemyśle papierniczym wspomagając obróbkę papieru. W gorzelnictwie poprawia (kluczowe dla końcowych walorów spożywczych produktu) procesy scukrzania i upłynniania.

Dekstranazę z kolei wykorzystuje się w przemyśle biotechnologicznym do syntezy oligosacharydów o działaniu prebiotycznym oraz w przemyśle farmaceutycznym do prowadzenia kontrolowanej biosyntezy dekstranu klinicznego.

Glukozoamylaza i pullulanaza hydrolizują wiązania α -1,6 - glikozydowe polisacharydów, wobec czego znalazły zastosowanie obok wcześniej wspomnianych enzymów tnących wiązania glikozydowe. Stosuje się je w piekarnictwie, browarnictwie i przy produkcji syropów. Pullulanaza może być wykorzystywana do produkcji kwasu mlekowego i alkoholu z surowców skrobiowych.

Pektynazy hydrolizują polimery kwasu galaktouronowego. Znalazły szerokie zastosowanie w przemyśle, z ich usług korzysta się w przemyśle spożywczym, przy obróbce owoców i produkcji soków, jako że poprawiają wydajność pozyskiwania soku z owoców oraz są przydatne podczas klarowania napoju. Używa się ich w przemyśle tekstylnym i papierniczym.

Wszystkie wyżej wzmiankowane enzymy przeprowadzają hydrolizę węglowodanów złożonych (zazwyczaj polisacharydów) do cukrów prostych. Różne gatunki syntetyzują również innego rodzaju białka o aktywności katalitycznej. Są nimi proteazy, czyli enzymy hydrolizujące wiązania peptydowe. Bakteryjne proteazy są stosowane jako dodatek do detergentów i wybielaczy. Przykładem może być alkaliczna proteza serynowa - subtylizyna. Proteazy stosuje się także przy produkcji aspartamu, stosowanego masowo (a czasami wręcz przesadnie, ponieważ niektórzy wykazują uczulenie na ten związek) jako środek słodzący. Używa się ich także w przemyśle tekstylnym do usuwania materiałów impregnujących z tkanin. Znajdują również zastosowanie przy produkcji piwa.

Lipazy (enzymy trawiące lipidy) również są stosowane w wielu odległych branżach, od przemysłu spożywczego zaczynając a na kosmetycznym kończąc. W przemyśle spożywczym używa się ich w cukiernictwie np. przy produkcji czekolady, mleczarstwo korzysta z ich możliwości przy produkcji serów, wykorzystywane są także w przetwórstwie mięsnym. Poza tym stosuje się je w garbarstwie do usuwania tłuszczu. Przy jego pomocy ulepsza się detergenty, stanowią także składnik produktów kosmetycznych.

Podobnie jak w przypadku większości substancji produkowanych przez mikroorganizmy mające zastosowanie w procesach przemysłowych także produkcja enzymów przez różne gatunki z rodzaju Bacillus musi znajdować się pod ścisłą kontrolą. Zazwyczaj zależy nam na maksymalnie prostym odzyskiwaniu uzyskiwanych produktów (co wiąże się z uwalnianiem enzymów do medium hodowlanego bądź sekwestracji w wakuoli- jakkolwiek jeżeli chodzi o enzymy ta ostatnia metoda nie znajduje praktycznego zastosowania) oraz ich znaczącą ekspresją. Tak jak w większości hodowli o znaczeniu przemysłowym możemy wyróżnić dwa najbardziej znaczące etapy, na których możliwa jest kontrola nad powstawaniem białka. Są to oczywiście transkrypcja i translacja, procesy, które już w trakcie normalnego wzrostu komórki bakteryjnej muszą być ściśle regulowane, i których znajomość umożliwia nam zastosowanie własnej aparatury kontrolnej bakterii w celu uzyskania pożądanych przez nas efektów. Kontrola na etapie transkrypcji jest związana z regulacją ilości powstającego matrycowego RNA (mRNA). Zazwyczaj zależy nam na uzyskaniu znaczących stężeń tego rodzaju kwasu nukleinowego kodującego interesujące nas białko. W czasie badań nad produkcją b- amylazy przez Bacillus amyloliquefaciens zauważono nawet dwukrotny wzrost stężenia mRNA (z 3 do 6% całkowitego RNA) kodującego ten enzym po zakończeniu fazy logarytmicznego wzrostu i rozpoczęciu się fazy plateau. Jak widać sama natura w pewien sposób reguluje szlaki metaboliczne powodując zmiany w ilości syntetyzowanego związku w zależności od potrzeb komórki. Niestety zastosowanie hodowli ciągłych, niejednokrotnie mających większe zastosowanie w przemyśle wiąże się niejako ad definitionem z zatrzymaniem hodowli bakteryjnej na etapie wzrostu logarytmicznego. Wiąże się to oczywiście z mniejszą niż możliwa wydajnością produkcji, a więc również spadkiem opłacalności procesu. Na szczęście możliwe jest zastosowanie manipulacji zwiększających produkcję bakteryjną. Pierwszą możliwością jest zwiększenie aktywności polimerazy RNA zależnej od matrycy DNA. Głównym powodem tak znacznego wzrostu stężenia mRNA w podanym powyżej przykładzie jest po prostu zwiększenie jego syntezy. I tak stosunkowo niewielka w fazie eksponencjalnego wzrostu transkrypcja genów kodujących egzoenzymy jest związana z niskim powinowactwem polimerazy do promotora. Zmiana w specyficzności polimerazy jest związana z przetasowaniami w tym enzymie a zwłaszcza ze zmianą podjednostki sigma odpowiadającej za kontakt z matrycą. Po zahamowaniu wzrostu nie ma dalszej inhibicji ekspresji genów nie kodujących genów konstytutywnych co powoduje oczywiście wzrost poziomu wydzielanego białka o znaczeniu przemysłowym.

Ryc. 2 Polimeraza RNA bez podjednostki sigma http://www.steve.gb.com/images/molecules/nucleotides/RNA_polymerase_(no_sigma).jpg

Teorię o kluczowym znaczeniu powinowactwa polimerazy do matrycy potwierdzają badania nad mutantami Spo0 Bacillus subtilis nie mającymi możliwości zmiany w specyficzności enzymu. Rezultatem jest brak ekspresji egzoenzymów. Kolejną możliwością kontroli ekspresji genów jest kontrola na poziomie translacji poprzez zmniejszenie szybkości degradacji mRNA. W tym przypadku możliwe jest zastosowanie kilku podejść. Przede wszystkim zauważono, że czas jaki mija od powstania mRNA do jego degradacji pozostaje w ścisłej korelacji z temperaturą prowadzenia hodowli. Jest to zależność dosyć intuicyjna, wydaje się oczywistym, że zwiększenie temperatury będzie prowadzić do zmniejszonej stabilności tak labilnych cząstek jak mRNA. i tak badania pokazały, że w przypadku transkryptu na proteinazy czas potrzebny do degradacji zwiększa się z niecałych trzech do ponad czterech minut przy obniżeniu temperatury z 37 do 30oC. Ta metoda kontroli jest bardzo prosta do zastosowania wymaga jedynie optymalizacji i uwzględnienia wymagań wzrostowych bakterii. Kolejnym typem kontroli jest modyfikacja transkryptu. Jest to jednak metoda niezbyt wygodna, nie mająca praktycznego zastosowania w procesach przemysłowych i z tego względu nie będzie ona szerzej omawiana. Godzi się jedynie wspomnieć, że ciekawą modyfikacją jest wprowadzenie do bakterii zarówno genu na docelowe białko z modyfikacjami typowymi dla organizmów wyższych (poliadenylacja, dodanie czapeczki guaninowej) stabilizujących mRNA oraz enzymów, które miałyby możliwość dokonywania translacji takiej cząsteczki kodującej. Jak już jednak wspomniano ze względu na dość duży stopień komplikacji metoda ta nie znalazła szerszego zastosowania w praktyce produkcyjnej. Innym podejściem do problemu degradacji przekaźnikowego RNA jest blokada (inhibicja) RNaz, które jak wiadomo są enzymami bardzo rozpowszechnionymi i o dużej aktywności. Jednak w przypadku bakterii z rodzaju Bacillus badania nad specyficznymi inhibitorami tych białek nie przyniosły spodziewanego rezultatu i z tego powodu nie ma możliwości tego rodzaju kontroli ekspresji jednego białka. Ciekawą metodą pozwalającą na otrzymanie hodowli bakteryjnej zdolnej do produkcji substancji związanych z fazą stacjonarną jest zatężanie poprzez zwirowanie mikroorganizmów a następnie ich zawieszenie w mniejszej niż poprzednio objętości medium hodowlanego. Pozwala to na ominięcie znacznej części wzrastania logarytmicznego co oznacza oszczędność czasu.

Nie wszystkie enzymy zewnątrzkomórkowe produkowane przez rodzaj Bacillus są syntetyzowane konstytutywnie. Część z nich może wymagać indukcji co otwiera wspaniałe możliwości do użycia tego typu nadzoru nad procesami zachodzącymi w bioreaktorze. Zwłaszcza dwa enzymy zasługują na przynajmniej krótkie omówienie- są to sacharoza lewanowa (LS) penicylinaza (beta laktamaza). Oba te enzymy ulegają ekspresji dopiero po odpowiedniej indukcji a zwłaszcza ten drugi jest szczególnie rozpowszechniony wśród różnych typów bakterii (najprawdopodobniej na skutek horyzontalnego transferu genów) co powoduje, że są szczególne pożądanym obiektem badań I tak sacharoza lewanowa jest enzymem zewnątrzkomórkowym, który w hodowlach z użyciem podłoża, w którym źródłem węgla jest glicerol jest praktycznie nie produkowany. Także przy dodatku 10-4M sacharozy indukcji ulegają raczej wewnątrzkomórkowe enzymy przeprowadzające rozkład tego disacharydu. Dopiero w warunkach, w których w podłożu znajduje się około sacharoza o stężeniu około 0,01M LS ulega indukcji i możliwe jest pozyskiwanie go z pożywki. Jeżeli chodzi o penicylinazę, enzym często używany w czasie selekcji koloni bakteryjnych po manipulacjach genetycznych to mechanizmy jej indukcji badano na przykładzie Bacillus cereus. Co ciekawe zapoczątkowanie ekspresji przez dodanie benzylopenicyliny (w stężeniu 2U/ml) nie powodowało natychmiastowej odpowiedzi. Faza lag upływająca od dodania induktora do powstania aktywnej formy enzymu wynosi 30 minut. Wynika to z faktu, iż związek powodujący pobudzenie syntezy nie może przenikać przez błonę i to jego związanie się do ściany komórkowej powoduje serię przekazań sygnału powodującą powstanie odpowiedzi komórkowej. Z drugiej strony trwająca w czasie ekspresja penicylinazy nie wynika z wiązania się kolejnych cząsteczek induktora a raczej z ciągłej interakcji induktor- komórka. Jakkolwiek znaczący wzrost ekspresji zauważamy dopiero po upływie pół godziny od stymulacji to poziom enzymu wystarczający do rozłożenia całkowitej ilości egzogennej penicyliny pojawia się już po upływie pięciu minut! Klasyczny eksperyment przeprowadzony Aten’ a i Day’ a w 1976 roku polegający na odczepieniu induktora od ściany komórkowej potwierdził proponowany mechanizm indukcji, w rzeczywistości unikalny dla tego enzymu. Należy jedynie zwrócić uwagę, że w czasie przeprowadzania eksperymentu sam zabieg odszczepiania cząsteczki mógł znacząco zmieniać metabolizm komórki powodując tym samym zafałszowanie wyników. Mimo wszystko proponowany mechanizm przyjął się w środowisku naukowym i do dnia dzisiejszego uchodzi za obowiązujący.

Ryc. 3 Centrum aktywne penicylinazy http://www.bioinfo.de/isb/1998/01/0008/fig2.jpg

Pomimo, że obydwa wyżej wzmiankowane enzymy stanowią koronne przykłady białek, których ekspresja ulega indukcji przez substancje dodawane do pożywki to uważa się obecnie, że większość białek katalizujących reakcje w komórce bakteryjnej może się znajdować pod kontrolą (przynajmniej częściowo) mechanizmów odpowiadających na bodźce pochodzące ze środowiska. Oznacza to, że mało który z enzymów zewnątrzkomórkowych można uznać za produkowany konstytutywnie co jest problemem dla każdego kto próbuje je produkować w ilościach odpowiednich dla pozyskiwania przemysłowego. Z drugiej strony stanowi to zaletę ponieważ istnieje możliwość kontroli powstawania enzymów w zależności od naszych wymagań. Co ważne kontrola syntezy enzymów zewnątrzkomórkowych (i to nie tylko u różnych gatunków Bacillus) musi się różnić od kontroli syntezy enzymów nie wydzielanych poza środowisko wewnątrz komórki. Wynika to oczywiście z faktu, że zazwyczaj każdy z szlaków metabolicznych jest hamowany przez ujemne sprzężenie zwrotne przez produkt reakcji katalizowanej przez ten enzym. Jednak aby było możliwe sprawowanie takiej kontroli produkt ten musiałby przekroczyć barierę ściany oraz błony komórkowej co jest możliwe jedynie w przypadku nielicznych związków. Pozwala to na „ręczną” regulację syntezy przez eksperymentatora i technika ta jest powszechnie stosowana w celu uzyskania białka w dużych ilościach umożliwiających jego oczyszczenie i izolację z medium hodowlanego. Kontrola np. powstawania proteaz (czy też ogólniej związków przeprowadzających degradację różnych cząsteczek) przebiega poprzez dodawanie do pożywki krótkich fragmentów odpowiadających produktom katalizowanym przez te enzymy. Uważa się obecnie, że mogą one pełnić rolę przekaźników powodujących zmiany w ekspresji białka. Dodatek tego typu związków powoduje inhibicję syntezy, podczas gdy umieszczenie substratów dla enzymu doprowadza do zwiększenia się jego poziomu (tak jak w przypadku dodania skrobi lub jej odpowiedników do hodowli B. polymyxa indukuje powstawanie beta amylazy). Na możliwości nadzorowania procesów produkcji enzymów wpływa również fakt, że genom różnych gatunków Bacillus, ze szczególnym uwzględnieniem B. subtilis został szczegółowo poznany. Bakterie te należą do często badanych w codziennej praktyce laboratoryjnej i z tego powodu opracowanie szczegółów postępowania nie nastręcza większych problemów.

Enzymy pozakomórkowe produkowane przez różne gatunki i szczepy Bacillus mimo, że nie są powszechnie znane dla swoich zastosowań przemysłowych zajmują jednak bardzo konkretną niszę. Z tego powodu bardzo ważne było opracowanie odpowiednich technik umożliwiających zaprzęgnięcie tych mikroorganizmów do pracy w służbie człowieka jako fabryk produkujących białko ze znaczną wydajnością. Na szczęście szereg faktów powoduje, że otrzymywanie ich na duża skalę jest stosunkowo proste. Przede wszystkim już sama lokalizacja powoduje, iż odzyskiwanie jest bardzo ułatwione- uwalnianie białek do pożywki powoduje znaczne zmniejszenie kosztów i skrócenie czasu potrzebnego na pozyskanie oczyszczonego białka. Nie ma także potrzeby zniszczenia komórek co równałoby się dosłownemu obróceni naszych „fabryk” w perzynę i rozpoczynanie całego czasochłonnego procesu od nowa. Duże znaczenie dla biotechnologii przemysłowej ma dobre zdefiniowanie odpowiednich warunków potrzebnych dla uzyskania najlepszych wyników z hodowli Bacillus. Oczywiście związane jest to z powszechnością hodowli tych bakterii, łatwością ich pozyskania ze środowiska(np. B. subtilis to powszechna bakteria glebowa), jak również stosunkowo niewielkimi wymaganiami wzrostowymi (w porównaniu np. do Leuconostoc). Wszystkie te fakty sprawiają, że dalsze badania nad produkcją enzymów zewnątrzkomórkowych przez te bakterie wydają się mieć głębokie uzasadnienie w realnych potrzebach przemysłu.

Żelan / ang. gellan gum/ jest to egzopolisacharyd pochodzenia bakteryjnego produkowany przez bakterię z rodzaju Sphingomonas. Pod względem struktury chemicznej jest to polimer, którego podstawową jednostką jest tetrasacharyd (rys.1), w którego skład wchodzą : b – D – glukoza (D – Glc), L – ramnoza (L – Rha), oraz D – glukuronian (D – GlcA). Żelan posiadać może nawet 50 000 takich reszt! Dodatkowo w obrębie struktury tego polimeru znaleźć można liczne „wtręty” niecukrowe, takie jak pyły, białka komórkowe czy jony wapniowe, które stabilizują helikalną strukturę przestrzenną żelanu.

Zaadoptowane z “Gellan Gum: Fermentative Production, Downstream Processing and Applications”

Obecnie znajduje coraz szersze zastosowanie nie tylko w laboratorium, ale również w przemyśle m.in. spożywczym (patrz Zastosowanie żelanu). W ofertach handlowych dostępny pod różnymi nazwami : Kelcogel, Gelrite, Phytagel i Gel – Gro.

Jedną z przyczyn, dla których żelan znajduje coraz więcej zwolenników są jego własności fizykochemiczne, głównie warunki jego przejścia w żel, stabilność temperaturowa i chemiczna. Poniżej zebrano najważniejsze informacje dotyczące jego właściwości :

• Przejście fazowe zol – żel w 35 ºC (wytworzenie struktury dwuniciowej helisy stabilizowanej mostkami solnymi i wiązaniami wodorowymi z wodą);

• Zawartość grup acetylowych – wpływ na wytrzymałość struktury żelu (forma deacylowana znacznie bardziej zbita i wytrzymała, ze względu na brak odpychania pomiędzy silnie elektroujemnymi ugrupowaniami);

• Żelan nie tworzy struktury trójwymiarowego żelu w wodzie zdejonizowanej (wymagana obecność jonów, głównie wapniowych, w celu stabilizacji struktury przestrzennej);
• Zmiana pH może mieć wpływ na różnice w temperaturze topnienia polimeru (obserwowane jedynie dla jonów jednowartościowych);
• Wysoka temperatura topnienia (przekraczająca nawet 100 ºC, w zależności od stężenia polimeru, stężenia kationów i warunków pH);
• Dodatek chelatorów takich jak EGTA, EDTA zmniejsza wytrzymałość żelu (wiążą one jony wapniowe stabilizujące strukturę żelu);
• Nieszkodliwy dla ludzi i zwierząt (niskie wchłanianie żelanu w jelitach – nietoksyczny, niekarcynogenny);

Zastosowanie żelanu w przemyśle spożywczym polega na wykorzystaniu go jako substancji solidyfikującej, zagęszczającej i pęczniejącej w różnego rodzaju produktach spożywczych, takich jak budynie, lody, jedzenie dla psów itp..

Przykładowe produkty zebrano w poniższej tabeli:

Żelan i jego pochodne znalazły liczne zastosowania w szeroko pojętej nauce m.in. do produkcji złóż hodowlanych dla mikroorganizmów termofilnych, ze względu na stosunkowo łagodne warunki polimeryzacji - do immobilizacji enzymów i komórek (np. drożdżowych) w bioreaktorach, w produkcji leków (kapsułki żelanowe – kontrolowane uwalnianie leku), do prowadzenia hodowli roślin in vitro lub do przeprowadzenia rozdziału elektroforetycznego (większa zdolność rozdzielcza niż żelu agarowego).

Wszystkie z wymienionych powyżej zastosowań stają się coraz bardziej popularne, co w niedługim czasie może doprowadzić do niemal całkowitego wyparcia agaru z naszych laboratoriów. Wynika to z nieprzeciętnych własności jakie posiada żelan. Jego zdolność rozdzielcza jest znacznie większa niż klasycznego żelu agarozowego, 1 % żel agarozowy ma taką samą rozdzielczość, co 0,125 % żelan (minusem jednak jest zjawisko elektroosmozy). Jest bezbarwny, co znacznie ułatwia detekcję zakażenia w prowadzonych przez nas hodowlach. Poza tym patrząc ze ściśle ekonomicznej perspektywy, jego produkcja jest znacznie bardziej wydajna i tańsza, niż produkcja agaru.

Obecnie organizmem najpospoliciej wykorzystywanym do produkcji tego polimeru są bakterie z grupy Sphingomonas paucimobilis. Pomimo tego, iż żelan produkuje się na skalę przemysłową od jakiś 16 lat (w 1992 został zatwierdzony przez FDA jako dodatek do produktów spożywczych), to dokładny mechanizm biochemiczny tego procesu, nadal nie jest do końca poznany. Z badań naukowców wynika jednak, iż synteza żelanu jest niejako wpleciona w szlak glikolizy prowadzonej przez te bakterie, oraz że kluczowym dla całego procesu jest dostarczenie substratów w formie aktywowanych prekursorów, tj. UDP – glukozy, TDP – ramnozy i UDP – glukuronianu. Poniżej przedstawiono zaproponowany przez naukowców biochemiczny szlak syntezy żelanu.

Zaadoptowane z “Gellan Gum: Fermentative Production, Downstream Processing and Applications”

Ponieważ celem tej monografii nie jest dokładna analiza biochemiczna procesu syntezy tego polimeru, to w naszych rozważaniach skupimy się głównie na aspektach typowo przemysłowej produkcji. Poniżej przedstawiono „krok po kroku”, od wyboru mikroorganizmu do odzysku gotowego produktu, aspekty związane z wydajną produkcją żelanu.

Obecnie najczęściej wykorzystywanym organizmem do produkcji żelanu na skalę przemysłową jest bakteria Sphingomonas paucimobilis – szczep ATCC 31461, którego wydajność produkcji żelanu wynosi około 36 g / litr hodowli. W porównaniu chociażby ze szczepem GS1, którego wydajność szacuje się na około 7 g / litr, widać iż szanujący się przedsiębiorca na pewno zaangażuje do produkcji właśnie szczep ATCC 31461, a nie żaden inny.

Szczep ATCC 31461 jest owocem żmudnej pracy inżynierów genetycznych, którzy poprzez wprowadzanie punktowych mutacji do genomu tej bakterii, znacznie zwiększyli wydajność na poziomie syntezy aktywowanych prekursorów, szybkości składania jednostek tetrasacharydowych ze sobą oraz na poziomie eksportu gotowego polimeru poza obszar komórki.

Zwykle w przemysłowej produkcji żelanu stosuje się kolumnowe reaktory z mieszadłem mechanicznym typu helical ribbon impeller. 250 obrotów na minutę, wydają się być najbardziej optymalne dla procesu produkcji, gdyż uzyskujemy wtedy odpowiednie wymieszanie i natlenienie pożywki, oraz unikamy wytworzenia się tzw. „martwych stref”, obszarów, które pomimo intensywnego mieszania, nie są „porywane” ze strumieniem krążącej w reaktorze cieczy. Powoduje to zaburzenia w wymianie masy i energii pomiędzy komórkami a pożywką.

Schemat przykładowego reaktora kolumnowego zamieszczono poniżej.

Media hodowlane używane w produkcji żelanu składają się w głównej mierze ze źródła węgla, azotu oraz soli nieorganicznych, niezbędnych do wzrostu bakterii. Czasem do pożywek dodaje się również witaminy. Ważne jest, aby skład pożywki był odpowiednio zbalansowany. Otóż udowodniono, iż najwydajniejszą produkcję żelanu uzyskuje się wtedy, gdy w pożywce hodowlanej zastosujemy bardzo duże stężenie źródła węgla (aby komórka mogła efektywnie zwiększać swoją masę) i minimalną ilość źródła azotu (aby komórka nie proliferowała, tylko rosła).

Metodą „prób i błędów” ustalono, że najwydajniejszym źródłem węgla jest melasa, natomiast najefektywniejszym źródłem azotu jest ekstrakt drożdżowy. Udowodniono również, iż zastosowanie ADP w stężeniu 1mM znacznie zwiększa wydajność procesu, co najprawdopodobniej ma związek ze zwiększoną produkcją wcześniej opisywanych aktywnych prekursorów.

Optymalne pH dla prowadzonych hodowli zawiera się w zakresie od 6,5 do 7. Odstępstwa od tych wartości mogą mieć znaczący wpływ na zaburzenia we wzroście komórek bakteryjnych.

Temperatura gwarantująca największą wydajność procesu syntezy żelanu to 25 ºC.

Natlenienie pożywki powinno wynosić, o ile to możliwe, 100 % DOT (dissolved oxygen tension), gdyż dla tej wartości stwierdzono największą produkcję żelanu przez komórki bakteryjne.

Na procedurę odzysku żelanu z pożywki składają się następujące czynności:

• Podgrzanie pożywki do temperatury 95 ºC przez około 10 minut – zabicie bakterii i zmniejszenie lepkości cieczy, odbiałczenie próbki metodami enzymatycznymi (uzyskanie zadowalających efektów sprawia największą trudność producentom);

• Filtracja (0,2 mm pory) lub odwirowanie żelanu z pożywki;

• Zebranie supernatantu i dodanie go do schłodzonego wcześniej izopropanolu – 12 h w temperaturze 4 ºC w celu sprecypitowania żelanu;
• *Oczyszczanie;

• Wirowanie;

• Suszenie przez 1 h w 55 ºC (alternatywnie liofilizacja);

Oczyszczanie uzyskanego produktu:

• Przemycie acetonem;

• Przemycie eterem;

• Rozpuszczenie w zdejonizowanej wodzie – aby nie wytworzył się żel;

• Dializa prowadzona przez 2 – 3 dni; alternatywnie można stosować sączenie molekularne (mniej popularne);

• Liofilizacja;

Liczenie pieniędzy

• „Gellan Gum : Fermentative Production, Downstream Processing and Applications”, Ishwar B. Bajaj, Shrikant A. Survase, Parag S. Saudagar and Rekha S. Singhal.

• http://en.wikipedia.org/wiki/Gellan_gum
• http://www.chinagellinng.com

• Statistical Approach to Optimization of Fermentative Production of Gellan Gum from Sphingomonas paucimobilis ATCC 31461”, shwar B. Bajaj, Parag S. Saudagar, Rekha S. Singhal, Ashok Pandey.
• „Extracellular Enzyme Synthesis in the Genus Bacillus”, Fergus G. Priest.
• http://www.mapol.pl/Prod/e2.html
• http://www.bart.pl/strona.php?31282