Bakterie z rodzaju Bacillus to drobnoustroje tlenowe, które ogólnie charakteryzują się zdolnością do formowania sporów, barwieniem gramdodatnim oraz niskim procentowym udziałem zasad GC w genomie. Częstą cechą ich komórek jest ruch czynny. Te saprofityczne bakterie glebowe rzadko powodują infekcje organizmów wyższych – ludzi i zwierząt.

Bakterie te można selektywnie wyizolować z gleby, kurzu czy jedzenia wykorzystując ich zdolność do formowania spor. Pobraną próbkę poddaje się pasteryzacji – 10 minut w 80 stopniach Celsjusza. Proces ten uśmierca komórki wegetatywne, promując powstanie form sporalnych, odpornych na ciepło i wysychanie oraz promieniowanie UV i o zdolności przetrwania nawet bardzo długiego okresu czasu. Następnie próbkę taką wysiewa się na medium i po inkubacji w warunkach dostępu powietrza otrzymuje się kolonie Bacillus.

Gatunki Bacillus zwykle wzrastają na zdefiniowanych pożywkach z dowolnym właściwie związkiem wykorzystywanym jako źródło węgla. Mogą być to kwasy nukleinowe, polisacharydy i tłuszcze, rozkładane dzięki zdolności do produkcji zewnątrzkomórkowych enzymów hydrolitycznych.

W przemyśle bakterii tego rodzaju używa się m.in. do produkcji preparatów owadobójczych – bioinsektycydów.

Antybiotyki produkowane przez mikroorganizmy stanowią metabolity wtórne, wytwarzane w wyniku jakościowej zmiany metabolizmu w komórce, przeważnie po zakończeniu fazy wzrostu lub w warunkach wyczerpania się podstawowych składników podłoża, np. źródła energii lub fosforu. W początkowym okresie badań nad antybiotykami twierdzono, iż pełnią one głównie funkcje ekologiczne w konkurencji między poszczególnymi drobnoustrojami w danej niszy środowiska naturalnego. Dla bakterii glebowych, jak te z rodzaju Bacillus, będących tematem tego opracowania, synteza antybiotyków miała stanowić ważną cechę warunkującą ich prawidłowy rozwój i przeżycie w niekorzystnych warunkach. Jednak tą teorię podważa fakt, że wiele drobnoustrojów może łatwo inaktywować i rozkładać antybiotyki, produkowane w warunkach naturalnych w ilościach często znikomych.

Dla wielu antybiotyków stwierdza się różnorodną aktywność biologiczną. Przykładem mogą być peptydowe liniowe gramicydyny i cykliczne tyrocydyny syntetyzowane przez Bacillus brevis zakłócające funkcjonowanie błony cytoplazmatycznej u bakterii gramododatnich. U samego B. brevis stanowią selektywne efektory ekspresji. Działając oddzielnie inhibują syntezę RNA, natomiast razem działają przeciwstawnie: gramicydyny znoszą inhibicję powodowaną przez tyrocydyny, co umożliwia selektywną transkrypcję wybranych genów procesu sporulacji. Z kolei cykliczna gramicydyna S hamuje proces kiełkowania form przetrwanych u tej bakterii.

Generalnie dość powszechnie znane są powiązania między procesem sporulacji a biosyntezą antybiotyków. Obserwuje się genetyczne sprzężenie tych procesów we wczesnym etapie. Antybiotyki peptydowe, jak stwierdzono badając mutanty asporogenne nie produkujące antybiotyków, mogą być efektorami procesu sporulacji. Przykładowo liniowa gramicydyna u Bacillus brevis jest uważana za specyficzny inhibitor polimerazy RNA, selektywnie blokujący transkrypcję pewnych operonów i przez to hamujący procesy podstawowe we wzroście wegetatywnym. Mutanty B. brevis, które utraciły zdolność do produkcji gramicydyny, okazały się niezdolne do formowania ciepłoodpornych przetrwalników.

Antybiotyki są także uważane za czynnik chroniący spory w środowisku naturalnym podczas procesu ich kiełkowania. U B. brevis wytwarzanie gramicydyny S oraz sporogeneza to procesy raczej niezależne, jednak znaczne ilości tego antybiotyku odkrywano w dojrzałych przetrwalnikach. Podczas ich kiełkowania antybiotyk był wydzielany do środowiska lub metabolizowany. Szczep dziki oraz mutant nie produkujący antybiotyku jednakowo wytwarzały przetrwalniki odporne na ciepło, jednak podczas ich kiełkowania zauważano następujące różnice: przetrwalniki szczepu macierzystego kiełkowały z opóźnieniem i nierównomiernie. Przy wprowadzeniu podłoża niesprzyjającego syntezie antybiotyku przetrwalniki obu szczepów kiełkowały jednakowo szybko. Obecność antybiotyku – inhibitora kiełkowania – w formach przetrwanych może być zatem korzystna dla przetrzymania złych warunków.

Dobrze poznanych jest parę gatunków bakterii z rodzaju Bacillus zdolnych do produkcji antybiotyków - w większości polipeptydów o niskiej masie cząsteczkowej. Związki te są często cykliczne a na pewno zróżnicowane pod względem budowy chemicznej, o masie cząsteczkowej od kilkuset do kilku tysięcy Da. Antybiotyki peptydowe są stosowane w medycynie głównie w leczeniu zakażeń bakteryjnych, ale przykładowo aktynomycyna D jest lekiem przeciwnowotworowym a cyklosporyna A immunosupresyjnym stosowanym w transplantologii.

Najważniejsze antybiotyki peptydowe produkowane prze rodzaj Bacillus zebrano poniższej tabeli wraz z ich krótką charakterystyką.

Na podanej poniżej stronie internetowej C.I.L. – Centrum Informacji o Leku – wpisując w okno wyszukiwarki nazwy powyższych antybiotyków, produkowanych przez rodzaj Bacillus, można odnaleźć leki, które zawierają je w swoim składzie: http://leki-informacje.pl/cpl/cpl_atecortin.php

Oprócz szczepów produkujących antybiotyki, wykorzystywanych w przemyśle farmaceutycznym, z rodzaju Bacillus można wyróżnić także szczepy wzorcowe, które służą badaniu aktywności antybiotyków, jak przedstawiono poniżej:

Szczepy produkujące antybiotyki
• Bacillus brevis IAW 58=PCM 2004 (gramicidin and tyrocidin)
• Bacillus licheniformis PCM 1847 (bacitracin)
• Bacillus polymyxa IAW 10=PCM 2010 (polymyxin)

Szczepy wzorcowe do badania aktywności antybiotyków
• Bacillus brevis PCM 2016 (penicillin)
• Bacillus cereus PCM 482=IAW 1 (tetracyclines)
• Bacillus subtilis PCM 486=IAW 16 (penicillins F, X and streptomycin)
• Bacillus subtilis IAW 15=PCM 1949 (2021) (many antibiotics, e.g. in body fluids)
• Bacillus subtilis IAW 17=PCM 2009 (chlorotetracycline and streptomycin)

Jednym z pionierskich antybiotyków produkowanych na skalę przemysłową była bacytracyna – produkt metabolizmu Bacillus subtilis. Wytwarzanie antybiotyków polipeptydowych w hodowli wyselekcjonowanych szczepów Bacillus to proces złożony i wieloetapowy. Materiał posiewowy wychodzi z aktywowanych liofilizowanych przetrwalników szczepu produkcyjnego na skosie agarowym, który zawiera glukozę, syrop ziemniaczany, wyciągi mięsne, namok kukurydziany oraz NaCl. Następnie z przetrwalników rozmnaża się w kilku etapach hodowlę wgłębną komórek wegetatywnych. Stanowią one inokulum procesu biosyntezy.

Używane podłoża posiewowe i produkcyjne zawierają przeważnie skrobię – pod postacią syropu ziemniaczanego – jako źródło energii i węgla. Namok kukurydziany dostarcza aminokwasów i soli mineralnych. Jako surowiec białkowy służy mąka sojowa lub arachidowa czy wyciąg mięsny. Dodaje się także do nich siarczanu amonu oraz węglanu wapnia.

Hodowlę prowadzi się w temperaturze 30-35 stopni Celsjusza, przy napowietrzaniu. Na dobór odpowiednich warunków ma wpływ użyty szczep oraz rodzaj antybiotyku. Materiał posiewowy hoduje się około kilkanaście godzin – aż populacja osiągnie koniec fazy wzrostu logarytmicznego. Aktywnie rosnącą hodowlą w ilości kilku procent szczepi się podłoże produkcyjne.

Proces samej biosyntezy prowadzi się znów zależnie od rodzaju antybiotyku i użytego szczepu w temperaturze 25 – 37 stopni Celsjusza z intensywnym mieszaniem i napowietrzaniem oraz chłodzeniem bioreaktora produkcyjnego. Zasadnicza produkcja antybiotyku może zachodzić już w czasie rozmnażania się komórek, jak to obserwuje się w przypadku biosyntezy polimyksyn w podłożu kompleksowym. W przypadku biosyntezy bacytracyny w podłożu syntetycznym obserwuje się proces dwufazowy – synteza antybiotyku następuje pod koniec fazy wzrostu i po jej zakończeniu.

Aby uzyskać maksymalną wydajność prowadzonego procesu produkcji antybiotyku jego biosyntezę prowadzi się jeszcze przez kilkanaście godzin po zakończeniu fazy wzrostu, co daje łączny czas produkcji – około 2 doby.

Następnie taki antybiotyk należy wyodrębnić. W przypadku bacytracyny po oddzieleniu biomasy i części stałych podłoża na prasie filtracyjnej ekstrahuje się ją z przesączu butanolem lub stosując chromatografię jonowymienną np. na złożu Amberlite DRC 50 lub MS-4 (http://www.rohmhaas.com/ionexchange/Pharmaceuticals/amberlite.htm#) Dalsze procesy poprzedzające otrzymanie czystej bacytracyny to oczyszczenie węglem aktywnym, zatężenie na wyparce próżniowej i wytrącenie w postaci soli z kationami dwuwartościowymi.

Do celów paszowych antybiotyk wytrąca się bezpośrednio z zawiesiny pohodowlanej w postaci soli cynkowej a następnie całą zawiesinę z biomasą i składnikami podłoża zatęża się w wyparce próżniowej, suszy i mieli by uzyskać produkt dobrze mieszający się z paszą.

Polimyksyny wyodrębnia się z przesączu pohodowlanego, nasyconego siarczanem amonu, metodą chromatografii jonowymiennej używając kationitów karboksylowych np. KB – 402 czy Wofatyt C, prowadząc elucję roztworem kwasu solnego lub siarkowego. Eluat następnie zobojętnia się na kolumnie z kationitom sulfonowym np. SBS – 1, a następnie polimyksyny wytrąca się roztworem amoniaku.

Znane są powiązania między sporulacją bakterii a biosyntezą antybiotyków peptydowych. Warunki tych procesów są często podobne. Inhibitory procesu sporulacji hamują również biosyntezę antybiotyków. Biosynteza antybiotyków jest objęta regulacją kataboliczną i następuje zazwyczaj po zakończeniu fazy intensywnego wzrostu bakterii, w warunkach wyczerpania się podstawowych składników podłoża, np. źródła węgla lub fosforu.

Genetyczne sprzężenie biosyntezy antybiotyków i sporulacji obserwuje się we wczesnym etapie sporogenezy; otrzymano mutanty asporogenne, które równocześnie nie produkowały antybiotyków. Prowadziło to do wniosku, że antybiotyki peptydowe mogą pełnić funkcję efektorów procesu sporulacji. Może się to przejawiać selektywnym hamowaniem syntezy makromolekularnych składników komórki wegetatywnej. Uważa się, że liniowa gramicydyna u Bacillus brevis jest wysoce specyficznym inhibitorem polimerazy RNA, selektywnie blokującym transkrypcję niektórych operonów i hamującym w ten sposób procesy podstawowe dla wzrostu wegetatywnego. Mutanty B. brevis, które utraciły zdolność produkcji gramicydyny, okazały się niezdolne do tworzenia normalnych, ciepłoodpornych przetrwalników.

Nie można wykluczyć, że poza regulatorową rolą w procesie sporulacji, antybiotyki pełnią funkcję inhibitorów lub aktywatorów metabolicznych podczas fazy spoczynkowej i kiełkowania spor; mogą być one również ważnym czynnikiem ochraniającym spory w środowisku naturalnym podczas kiełkowania. Wytwarzanie gramicydyny S u B. brevis zachodzi przed rozpoczęciem sporogenezy i obydwa te procesy, jak ustalono doświadczalnie, są w pewnym stopniu od siebie niezależne. Znaczne ilości antybiotyków stwierdzono jednak w dojrzałych przetrwalnikach. Podczas kiełkowania przetrwalników gramicydyna S była wydzielana do środowiska lub metabolizowana. Stwierdzono, że zarówno szczep macierzysty, jak i jego mutant nie wytwarzający antybiotyku jednakowo obficie wytwarzały ciepłoodporne przetrwalniki. Różnica przejawiała się dopiero w momencie kiełkowania przetrwalników. Przetrwalniki szczepu rodzicielskiego kiełkowały nierównomiernie i z pewnym opóźnieniem; jeżeli jednak uprzednio wyekstrahowano z nich gramicydynę S lub jeżeli wcześniej przetrwalnikowanie prowadzono w podłożu niesprzyjającym syntezie antybiotyku, wówczas przetrwalniki obu szczepów kiełkowały jednakowo szybko. Obecność w przetrwalnikach antybiotyku - inhibitora kiełkowania może być zatem korzystna dla przetrzymania niekorzystnych warunków i dalszego rozwoju.

Nic tak nie przybliża zagadnienia jak porządnie i profesjonalnie przygotowany schemat. Poniżej widać schemat zaczerpnięty z pracy Waites W.M. Sporulation of Bacillus subtilis (1970) przedstawiający poszczególne stadia obserwowane w czasie procesu sporulacji oraz morfologiczne i biochemiczne zmiany z jakimi mamy wówczas do czynienia. Wyróżnić można siedem stadiów sporulacji (liczby rzymskie). Na schemacie poniżej pominięto pierwsze stadium (formowanie filamentów chromatynowych), gdyż etap ten nie zawsze jest łatwy do odróżnienia od normalnej komórki wegetatywnej. Dodatkowo dla przejrzystości połączono etap V i VI. Materiał genetyczny jest ukazany jedynie na tych stadiach, gdzie można go dostrzec pod mikroskopem elektronowym. Czarne kreski oznaczają etapy na których proces sporulacji jest zaburzony w dostępnych mutantach wykorzystywanych do badania tego procesu.

Kolejny rysunek (zaczerpnięty z www.textbookofbacteriology.net/Bacillus.html) przedstawia budowę dojrzałej endospory. Zaznaczono egzosporium, osłonę spory, korteks oraz ścianę komórkową komórki wegetatywnej.

Czy jest coś piękniejszego od sporulującego Bacillusa? Oczywiście, a przynajmniej twierdzi tak co najmniej jeden z autorów tego opracowania. Mimo to zdjęcia z mikroskopu fluorescencyjnego przedstawiające Bacillus subtilis są na prawdę ładne. Jedno z nich przedstawiono poniżej (probes.invitrogen.com/handbook/boxes/2034.html).

Jeśli chcesz zaadoptować jakiegoś pięknego Bacillusa lub innego równie ładnego mikroba zajrzyj na http://adoptamicrobe.blogspot.com/2007/01/bacillus-subtilis.html.

Lantybiotyki stanowią grupę wyjątkowych antybiotyków peptydowych w większości produkowanych przez i działających na bakterie gramdodatnie. Ten z pozoru tajemniczy termin został wprowadzony pod koniec lat 80 ubiegłego wieku i stanowi skrótową nazwę antybiotyków peptydowych zawierających lantioninę wykazujących silne działanie antybakteryjne. Obecnie wśród związków zaliczanych do lantybiotyków znaleźć można również inne nietypowe aminokwasy: niektóre występujące częściej takie jak dehydroalanina, inne bardziej „unikatowe” jak na przykład kwas erytro-3-hydroksyasparaginowy. Wspomniane nietypowe aminokwasy powstają w wyniku potranslacyjnych modyfikacji łańcuchów bocznych aminokwasów w prekursorowych peptydach syntetyzowanych na rybosomach. Obecność niecodziennych aminokwasów wymaga zatem odpowiednich równie niecodziennych szlaków biosyntetycznych. W niektórych opracowaniach zwrócona jest uwaga na „pokrewieństwo” antybiotyków z bakteriocynami.

Lantybiotyki można podzielić na dwie grupy : A i B, w zależności od ogólnej budowy, masy cząsteczkowej czy ładunki elektrycznego jakim są obdarzone ich cząsteczki. Ogólnie, do grupy A zalicza się lantybiotyki z dodatnim ładunkiem między +2 a +7 podczas gdy antybiotyki z grupy B charakteryzują się mniejszym ładunkiem. Lantybiotyki grupy A produkowane są przez bakterie z rodzajów Lactococcus, Lactobacillus, Staphylococcus, Streptococcus i co najważniejsze Bacillus. Opisywane są jako wydłużone, liniowe peptydy o masie cząsteczkowej 2100 – 3500 Da. Ponieważ w tym artykule interesują nas antybiotyki otrzymywane z bakterii rodzaju Bacillus należy w szczególności wspomnieć o subtylinie. Mimo, że lantybiotyki z grypy B produkowane są głownie przez Streptococci, również i tu można znaleźć przedstawiciela produkowanego przez Bacillus – mersacydynę. Lantybiotyki grypy B są białkami globularnymi o masie 1800 – 2100 Da i przeważnie o słabej aktywności antybakteryjnej.

Niemniej jednak obecnie wszystkie lantybiotyki budzą spore zainteresowanie naukowców, a ich zastosowanie w przyszłości może okazać się ogromne począwszy od chemoterapii rozlicznych schorzeń wywołanych bakteriami poprzez konserwację pożywienia a skończywszy na dezodorantach i konserwantach kosmetyków. Bez wątpliwości wraz z rozwojem nauki, poznawaniem nowych biologicznie czynnych związków oraz sekwencjonowaniem genomów potencjalnych ich producentów tego typu środki przeciwdrobnoustrojowe znajdą zastosowanie w wielu dziedzinach życia.

Aktywność antybakteryjna subtyliny produkowanej przez Bacillus subtilis ATCC 6633 została po raz pierwszy opisana w roku 1944 i mniej więcej w tym samym czasie została wyizolowana i scharakteryzowana. Subtylina jest podobna do nizyny – oba te antybiotyki zawierają takie same modyfikacje aminokwasów w takich samych pozycjach – jednak zauważalne są znaczące różnice w budowie tych związków. Cechą wyróżniającą subtylinę jest posiadanie dwóch różnych aktywności antybakteryjnych: jednej – skierowanej przeciwko komórkom wegetatywnym i drugiej – uniemożliwiającej rozwój bakterii z endospor. Subtylina jest stosunkowo nietrwała (szacuje się, że jej czas półtrwania wynosi zaledwie pół dnia w 4°C), a utrata aktywności jest związana z nasyceniem wiązania dehydroalaniny (Dha5).

Subtylina może być stosowana jako środek konserwujący żywność. Mimo, iż jak wspomniano wcześniej antybiotyk ten jest stosunkowo nietrwały, jest na tyle wytrzymały, aby przetrwać od 30 do 60 minut w temperaturze 121°C co okazuje się być bardzo ważną cechą. Subtylina działa efektywnie jako konserwant żywności przechowywanej w konserwach przy ilościach rzędu 5 – 20 ppm zapobiegając kiełkowaniu endospor oraz obniża ich termiczną odporność. Mimo, iż skuteczność subtyliny może być tak wysoka jak w przypadku nizyny z przyczyn nie do końca jasnych poświęcane jest jej niewiele uwagi. Stosowanie subtyliny jako dodatku do żywności podobnie jak w wielu innych krajach, w Unii Europejskiej nie jest dozwolone. W Korei Południowej działa natomiast firma oferująca produkty z fermentowanej soi zawierające subtylinę. Znajdujący się w oferowanej przez nich żywności lantybiotyk produkowany jest przez Bacillus subtilis podczas prowadzonej fermentacji. Cała gama „przysmaków” oferowana jest pod marką Subtiyou (www.subtiyou.com). Jak twierdzi producent ich produkty mają również działanie przeciwnowotworowe i stymulujące układ odporności. Oferowane na ich stronie internetowej fermentowane lody sojowe muszą być pyszne ;] (patrz obok). Poniżej przedstawiono jeden z przysmaków w trakcie produkcji (po lewej) i po zapakowaniu (po prawej).

Subtylina (jak również i inne lantybiotyki) może być stosowana jako środek leczniczy w terapii zespołu suchego oka (łac. Xerophtalmia). Pierwsze patenty opisujące postać stosowanego leku, dawkowanie oraz działanie pojawiły się w 2002 roku. Potencjalne wykorzystanie antybiotyków jest dużo szersze i obejmuje także inne schorzenia takie jak rumień wielopostaciowy (w formie zespołu Stevena – Johnsona), syndrom Sjorgena czy rodzinna dysautonomia. Niemniej jednak zasotosanie subtyliny i jej podobnych jest wciąż w fazie badań i prób klinicznych i terapia z ich zastosowaniem prowadzona może być tylko przez doświadczonych specjalistów.

Mersacydyna produkowana przez bakterie z rodzaju Bacillus (Bacillus HIL Y-85,54728) jest antybiotykiem pod kilkoma względami wyjątkowym. Jest najmniejszym przedstawicielem tego typu związków (1825 Da), jest hydrofobowa i nie jest obdarzona ładunkiem elektrycznym. Dodatkowo oprócz reszty Dha i trzech reszt MeLan, mersacydyna jest jedynym lantybiotykiem zawierającym C-końcową S-aminowinylo-metylo-cysteinę.

Działanie mersacydyny polega na hamowaniu biosyntezy peptydoglikanu na poziomie transglikozylacji. Inhibicja wynika z oddziaływania tego lantybiotyku ze związanym z błoną prekursorem peptydoglikanu – undekaprenylo-pirofosforylo-MurNAc-(pentapeptyd)-GlcNAc (lipidem II), co przedstawiono na rysunku poniżej:

Oprócz antybiotyków peptydowych, rodzaj Bacillus jest znany z produkcji antybiotyków „nierybosomowych” zawierających w swojej strukturze łańcuchy kwasów tłuszczowych i wykazujących działanie antybakteryjne i antywirusowe. Sztandarowym przykładem tego typu związów jest surfaktyna. Zdawać sobie należy jednak sprawę z faktu iż tego typu związków jest dużo więcej. Można wymienić tu między innymi bacilysocynę, fengicynę czy związki należące do grupy ituryn.

Podczas gdy peptydowe antybiotyki „rybosomowe” są produkowane w fazie aktywnego wzrostu bakterii, antybiotyki „nierybosomowe” są syntetyzowane dopiero po zatrzymaniu wzrostu. Rola tego typu antybiotyków jest do tej pory nie w pełni poznana. Ciesząca się największą popularnością i akceptacją hipoteza mówi, że takie antybiotyki mogą pełnić rolę w konkurencji z innymi mikroorganizmami na etapie spor.

W badaniach nad „nierybosomowymi” antybiotykami bardzo dużą rolę odegrał Bacillus subtilis 168. Jest to szczep najlepiej poznany, jego genom został w pełni zsekwencjonowany (w roku 1997) i na podstawie analizy jego sekwencji wiele odkryć w dziedzinie antybiotyków zostało dokonanych.

Surfaktyna jest cyklicznym lipopeptydem wykazującym aktywność antybiotyku. Jej amfipatyczne właściwości sprawiają, iż jest ona trwała i aktywna zarówno w środowisku hydrofobowym jak i hydrofilowym. Jest ona pochodzenia nierybosomowego, syntezę przeprowadza enzym znany jako syntetaza surfaktyny. Aminokwasy prekursorowe w jej szlaku biosyntezy są aktywowane na drodze reakcji wymiany ATP-Pi. Takiej aktywacji ulegają wszystkie budujące ją aminokwasy. Surfaktyna została po raz pierwszy wyizolowana z Bacillus subtilis ATCC 1332. Jest znana jako silny biosurfaktant (obserwowane jest obniżenie napięcia powierzchniowego z 72 do 27 mN/m) oraz inhibitor zależnej od Ca²⁺ i Mg²⁺ fosfodiesterazy cyklicznego 3’-5’-adenozynomonofosforanu. Zaobserwowana inhibicja zachodzi najprawdopodobniej poprzez zdolność do chelatowania jonów przez wolne grup karboksylowe kwasów glutaminowego i asparaginowego. Przypuszczenia te potwierdzają obserwacje przeprowadzone na szczepach B. subtilis 23 oraz N znanych również jako producenci antybiotyków podobnych do surfaktyny. Izolacja surfaktyny może być przeprowadzona z użyciem klasycznych metod stosowanych dla innych substancji biologicznie czynnych. Surfaktyna wykazuje działanie przeciw bakteriom, wirusom, grzybom i mykoplazmom. Ma również aktywność hemolityczną. Właściwości antybakteryjne i antywirusowe wynikają ze zdolności surfaktyny do solubilizacji błon biologicznych a także potencjalnej zdolności do tworzenia porów w błonie komórkowej.

Surfaktyna ma jedną poważną wadę, mianowicie niespecyficzna cytotoksyczność prowadzącą finalnie do lizy traktowanej nią komórki. Całe szczęście taki scenariusz możliwy jest jedynie przy dużych stężeniach surfaktyny (powyżej 50 μM), a tak duże dawki nie są wymagane, aby działanie surfaktyny było obserwowane przeciwko drobnoustrojom. Stąd przy odpowiednich stężeniach działanie surfaktyny nie wydaje się być groźne dla ludzi.

Surfaktyna produkowana przez Bacillus subtilis powoduje zahamowanie rozwoju S. coelicolor bez substratowej inhibicji wzrostu. Góra – kolonia dzikiego szczepu Bacillus subtilis (w centrum) otoczona murawką S. coelicolor na płytce agarowej. Strzępki powietrzne są białe i sprawiają wrażenie „włochatych”. Pusta przestrzeń, bez S. coelicolor otacza kolonię B. subtilis. Dół – Bacillus subtilis – mutant surfaktyny nie jest zdolny do zahamowania rozwoju S. coelicolor, co objawia się brakiem widocznej powyżej łysinki.

W cyklu rozwojowym bakterii z rodzaju Bacillus synteza antybiotyków polipeptydowych poprzedza proces sporogenezy lub występuje we wczesnych jego etapach. U szczepów dzikich zachodzi ona intensywnie najczęściej po zakończeniu fazy wzrostu wykładniczego i (podobnie jak proces sporulacji) podlega regulacji katabolicznej. U szczepów produkcyjnych często można obserwować jednak wytwarzanie antybiotyku już podczas fazy wzrostu. U wysoko wydajnego szczepu B. brevis stwierdzono, że enzymy I i II odpowiedzialne za syntezę gramicydyny S są wytwarzane równolegle z rozmnażaniem się komórek. Produkcję antybiotyków w czasie fazy wzrostu wykładniczego obserwuje się również w procesie biosyntezy bacytracyny przez B. licheniformis czy kolistyny u B. colistinus. Cechą charakterystyczną enzymów biorących udział w biosyntezie antybiotyków polipeptydowych jest niecałkowita specyficzność. Prowadzi to powstawania kilku lub nawet kilkudziesięciu podobnych lecz nie identycznych produktów końcowych w hodowli jednego szczepu (przyczynia się do tego wbudowywanie zamiennych aminokwasów o podobnej strukturze lub ich analogów). Jako przykład może tutaj posłużyć B. brevis wytwarzający tyrocydyny A, B i C w stosunku molowym 1 : 3 : 7. Na biosyntezę polipeptydów bakteryjnych ma także regulujący wpływ represja kataboliczna, regulacja fosforanowa oraz hamowanie produktem końcowym (sprzężenie zwrotne ujemne).

• Aleksander Chmiel: Biotechnologia: podstawy mikrobiologiczne i biochemiczne. Wydaw. Nauk. PWN, Warszawa 1994
• http://gasp.med.harvard.edu/members_research/pstraight.html
• www.subtiyou.com
• http://twistedbacteria.blogspot.com/2008/05/to-sporulate-or-not-to-sporulate.html
• Zdzisław Markiewicz, Zbigniew A. Kwiatkowski: Bakterie, antybiotyki i lekooporność. Wydawnictwo Naukowe PWN 2006.
• Mannanov R. N., Sattarova R. K.: Antibiotics produced by Bacillus bacteria. „Chemistry of Natural Compoumds” 2001 vol. 37, No. 2, s.117-123
• Sahl H. G., Jack R. W., Bierbaum G.: Biosynthesis and biological activities of lantibiotics with unique post-translational modifications. Eur. J. Biochem. 1995 230, 827-853
• Tamehiro N. et al.: Bacilysocin, a Novel Phospholipid Antibiotic Produced by Bacillus subtilis 168. „Antimicrobial Agents and chemotherapy” 2002 vol. 46, No. 2, s. 315-320
• Martirani L. et al.: Purification and partial characterization of bacillocin 490, a novel bacteriocin produced by a thermophilic strain of Bacillus licheniformis. „Microbial Cell Factories” 2002
• Chatterjee S. et al.: Mersacidin, a new antibiotic from bacillus. Fermentation, isolation, purification and chemical characterization. „The Journal of Antibiotics” 1992 vol. 45, No. 6, s.832-838
• Nagao J. et al.: Lantibiotics: Insight and Foresight for New Paradigm. „Journal of Bioscience and Bioengineering” 2006 vol. 102, No. 3 s.139-149
• Brotz H.et al.: The Lantibiotic Mersacidin Inhibits Peptidoglycan Synthesis by Targeting Lipid II. „Antimicrobial Agents and chemotherapy” 1998 vol. 42, No. 1 s.154-160
• Waites W. M. et al.: Sporulation of Bacillus subtilis: Correlation of biochemical events with morphological changes in asporogenous mutants. Biochem. J. 1970, 118, s.667-676

Kwas fumarowy (kw. trans-1,2-etylenodikarboksylowy; kw. (E)-2-butenodiowy; rys 1.) to występujący naturalnie, nienasycony kwas dikarboksylowy. Po raz pierwszy wyizolowany został z rośliny Fumaria officinalis (rys. 2)od której to wziął swoją nazwę.

Rys. 1:

Rys. 2:

Wiele mikroorganizmów także produkuje ten związek, gdyż jest on jednym ze związków pośrednich cyklu kwasu cytrynowego. Obecnie produkowany jest on głównie metodą chemiczną z bezwodnika kwasu maleinowego, który to z kolei otrzymywany jest z butanu. Rosnące ceny ropy naftowej i produktów ropopochodnych (w tym bezwodnika kw. maleinowego) powodują, iż synteza mikrobiologiczna kwasu fumarowego wzbudza ponowne zainteresowanie – metoda ta wykorzystywana była dosyć sprawnie w latach 40 XX wieku, jednakże w latach późniejszych zastąpiona została przez wówczas bardziej opłacalny proces petrochemiczny. W porównaniu do pokrewnych kwasu fumarowego innych kwasów dikarboksylowych (bursztynowego i maleinowego)kw. fumarowy odznacza się niską rozpuszczalnością w wodzie (7g/kg w temperaturze 25°C; 89 g/kg w temperaturze 100°C), a także niską wartością pK_a (3,03 oraz 4,44), które to właściwości wykorzystane mogą być przy odzyskiwaniu i oczyszczaniu produktu.

Ze względu na swą strukturę (dwie grupy karboksylowe oraz wiązanie podwójne) kwas fumarowy jest dogodnym substratem do reakcji polimeryzacji czy estryfikacji (obecnie preferowany jest bezwodnik maleinowy jednak zaletą kw. fumarowego jest całkowity brak toksyczności, a ponadto daje on polimery o nieco odmiennej charakterystyce). Własność ta wiąże się ściśle z zastosowaniem kwasu fumarowego w produkcji polimerów takich jak nienasycone żywice poliestrowe, żywice papierowe czy alkidowe. Poza reakcjami polimeryzacji kw. fumarowy stosowany jest w przemyśle spożywczym jako dodatek do żywności i napojów (o symbolu E297) pełniący głównie rolę regulatora kwasowości używanego czasami w zamian za kwas cytrynowy, a także jako substrat w produkcji kwasu bursztynowego czy maleinowego. W medycynie estry kwasu fumarowego stosowane są do leczenia ciężkich przypadków łuszczycy. Potencjalnym zastosowaniem jest użycie kw. fumarowego jako dodatku do pasz dla bydła – niedawne badania wykazały bowiem, iż dodatek taki powoduje znaczną (do 70%) redukcję emisji metanu przez bydło, będącego jednym z gazów cieplarnianych. Inne zastosowania to produkcja olei nawilżających, tuszy, lakierów, odczynników karboksylujących czy kosmetyków.

[Roa Engel C. A. et al. 2008, zmodyfikowany]

Istnieje wiele aspektów determinujących ilość uzyskanego kwasu fumarowego w jego produkcji poprzez fermentację. Produktywność zależy nie tylko od zastosowania konkretnego szczepu i jego morfologii, lecz także od rodzaju czynników neutralizujących czy zastosowanej pożywki. Szczepy stosowane w produkcji kw. fumarowego. Po odkryciu w roku 1911 przez Feliksa Ehrlicha produkcji kwasu fumarowego u Rhizopus nigricans (rys. 3a i b) Foster i Waxman (1938) przebadali 41 szczepów z 8 różnych rodzajów w celu identyfikacji szczepów produkujących duże ilości kwasu fumarowego. Zidentyfikowane rodzaje produkujące kw. fumarowy to Rhizopus, Mucor, Cunnighamella i Circinella wśród których szczepy Rhizopus sp. (nigricans, arrhizus, oryzae i formosa) odznaczały się najwyższą produktywnością dając „plon” w warunkach zarówno tlenowych jak i beztlenowych.

Rys. 3a:

Rys. 3b:

Poniżej zamieszczono tabelę [Roa Engel C. A. et al. 2008] prezentującą dane literaturowe odnośnie produkcji kw. fumarowego przez szczepy Rhizopus sp.

Pomimo, iż wspomniane wcześniej badania dotyczyły grzybów, to użycie bakterii także było rozważane – proponowano np. użycie zmodyfikowanego genetycznie szczepu z rodzaju Lactobacillus.

Jak wspomniano wcześniej kwas fumarowy jest istotnym związkiem pośrednim w cyklu kwasu cytrynowego. Nie jest to jednak główna ścieżka metaboliczna prowadząca do wysokiej produkcji kwasu fumarowego w zidentyfikowanych wcześniej drobnoustrojach. W szczepach tych kwas fumarowy produkowany jest głównie poprzez ścieżkę redukcyjnej karboksylacji, której enzymy, w przeciwieństwie do mitochondrialnych enzymów cyklu Krebsa, znajdują się w cytoplazmie i prowadzą od pirogronianu poprzez szczawiooctan i maleinian do fumaranu (rys. 4). Ta alternatywna ścieżka umożliwia użycie czterowęglowych związków pośrednich cyklu Krebsa dla celów biosyntezy podczas fazy wzrostu w warunkach tlenowych. W momencie, gdy dostępność azotu jest limitowana i wzrost ustaje, metabolizm glukozy i wiązanie CO₂ mogą być kontynuowane i prowadzić do akumulacji kwasów C₄ – czyli także fumarowego.

Rys. 4: [Roa Engel C. A. et al. 2008]

Mechanizm transportu kwasu fumarowego u grzybów nie został do tej pory zbadany, niemniej jednak transport innych kwasów dikarboksylowych u drożdży takich jak Schizosaccharomyces pombe, Candida utilis , Candida spaerica czy Hansenula anomala był badany. Organizmy te mogą być porównane do grzybów produkujących kwas fumarowy. Badania sugerują transport z wykorzystaniem symportu kwasów dikarboksylowych razem z protonami. Znajomość mechanizmu transportu umożliwiłaby zwiekszenie usuwania fumaranu z cytoplazmy co miałoby pozytywny wpływ na ilość uzyskiwanego produktu (ogólny mechanizm hamowania szlaku syntezy przez produkt końcowy).

Glukoza nie jest jedynym źródłem węgla jaki można stosować przy hodowli szczepów produkujących kwas fumarowy. Alternatywnie stosować można ksylozę, sacharozę czy mąkę ziemniaczaną, dają one jednak mniejszą objętościową produktywność. Najwyższą ilość produktu uzyskano jednak nie z glukozy tylko z kwasowych hydrolizatów materiałów opartych na skrobii. Jeśli chodzi o fizyczne warunki hodowli oraz wymagania odżywcze to badane były one dla Rhizopus nigricans. Produkcja kwasu fumarowego (fermentacja) przez Rhizopus zachodzi dopiero w fazie zwolnionego wzrostu i stacjonarnej która może zostać osiągnięta poprzez limitację źródeł azotu. Jak okazało się najbardziej krytycznym parametrem w osiąganiu wysokiej produkcji fumaranu ma stosunek glukozy do azotu. Gdy z pewnych przyczyn ograniczone azotu nie jest możliwe można zastosować niedobór fosforu. Istotnym składnikiem są jony metali, których najważniejsze to Mg²⁺, Zn²⁺ i Fe²⁺, których odpowiednie stężenia pozwalają na tworzenie przez grzyba niewielkich sferycznych peletów dających wysokie stężenie kwasu fumarowego. Niezbędnym składnikiem jest CO₂, potrzebny do utworzenia (szczawiooctanu), który może być dostarczany do mieszaniny w postaci CaCO₃ często używanego jako środek neutralizujący.

Gromadzący się w pożywce kwas fumarowy powoduje spadek pH, w którym kwas fumarowy może pasywnie wnikać z powrotem do komórek grzyba hamując swoją własną syntezę. Dlatego niezbędne okazało się użycie środków neutralizujących. Zazwyczaj w tym celu stosuje się sole węglanowe, które poza neutralizacją dostarczają także niezbędnego dwutlenku węgla, dzięki czemu niepotrzebne jest jego dodatkowe suplementowanie do pożywki. Zgodnie z wynikami, środkiem neutralizującym pozwalającym na otrzymanie największej ilości produktu jest CaCO₃. Niestety posiada on taką wadę, iż fumaran wapnia jest solą słabo rozpuszczalną w wodzie (21 g/l w temperaturze 30°C), co powoduje wzrost lepkości roztworu w reaktorze (problemy z mieszaniem) i może prowadzić do precypitacji soli z roztworu. Dodatkowo komórki grzyba (R.oryzae) mogą wchodzić w interakcję z takimi precypitatami tworząc wyjątkowo lepką mieszaninę, w której pojawia się już limitacja tlenowa i wynikające z tego zahamowanie fermentacji. Inne możliwe środki neutralizujące to Na₂CO₃, NaHCO₃, Ca(OH)₂ czy (NH₄)₂CO₃ – ten ostatni może być stosowany, gdy do indukcji fermentacji użyte jest ograniczenie źródeł fosforu zamiast azotu.

Jedną z przeszkód prowadzenia fermentacji z użyciem Rhizopus jest morfologia tych grzybów – mają one tendencję do wzrostu na ściankach i mieszadle reaktora. Czasami tworzą także większe agregaty co powoduje problemy z dostępnością tlenu, zwłaszcza gdy w mieszanine obecny jest fumaran wapnia. Obniżenie problemów z dostępem tlenu uzyskuje się poprzez stymulację grzyba do tworzenia niewielkich, sferycznych peletów – u R. oryzae jest to np. niskie początkowe pH pożywki. Lepsze natlenienie próbuje się ponadto uzyskać poprzez użycie alternatywnych bioreaktorów. Najlepszą produktywność uzyskano przy użyciu rekatora RBC (rotary biofilm contactor) w którym podczas fermentacji dyski z immobilizowanymi komórkami grzyba obracając się powodują, iż komórki na przemian znajdują się to w fazie płynnej (pożywce) w której zachodzi produkcja kw. fumarowego to w fazie gazowej, pozwalającej na dotlenienie. Jeśli chodzi o metody immobilizacji komórek Rhizopus to byłyone badane i obejmowały takie nośniki jak korek, polistyren, glina czy wióry. Inne metody zaradzenia niedotlenieniu to zwiększenie ciśnienia gazu czy uzycie reaktora typu airlift.

Poniżej przedstawiono schematycznie proces produkcji okresowej (typu batch) kwasu fumarowego (rys. 5). Glukoza i sole mineralne (a) doprowadzane są bezpośrednio do fermentora (c), natomiast źródło azotu, (NH₄)₂SO₄, jest sterylizowane osobno i doprowadzane do fermentora wstępnego (b). Następnie pożywka zawierająca fumaran sodu (czynnik neutralizujący w postaci Na₂CO₃), komórki grzyba i śladowe ilości Na₂CO₃ jest filtrowana (d) w celu pozbycia się komórek a następnie zakwaszana poprzez dodatek H₂SO₄ do pH 1(e). Po zakwaszeniu wytrącony kwas fumarowy jest odfiltrowywany (f), a następnie suszony na suszarce obrotowej (g). W przypadku użycia Ca₂CO₃ jako środka neutralizującego wymagane jest dodatkowe podgrzanie mieszaniny po fermentacji w celu rozpuszczenia fumaranu wapnia co niestety prowadzi do stosunkowo skomplikowanych i drogich procesów odzyskiwania produktu i jego oczyszczania (downstream processing).

Rys. 5: [Roa Engel C. A. et al. 2008, zmodyfikowany]

• Roa Engel C. A. et al.: Fumaric acid production by fermentation. Appl Microbiol Biotechnol. 2008 No.78(3) s. 379–389
• Aleksander Chmiel: Biotechnologia: podstawy mikrobiologiczne i biochemiczne. Wydaw. Nauk. PWN, Warszawa 1994
• http://www.plant-identification.co.uk/skye/papaveraceae/fumaria-officinalis.htm
• http://www.telmeds.org/AVIM/Amico/hongos_contaminantes/hongos_contaminantes_comunes.htm
• http://www.chemzak.pl/?act=kwas_fumar